荧光定量PCR技术在监测目标赤潮藻及孢囊中的应用

正确鉴定和快速定量检测赤潮原因种及孢囊是进行赤潮研究和预警的前提和基础，而赤潮藻形态鉴定经验依赖性强，特别是对于具毒卡尔藻等个体微小且较细胞壁的种类和孢囊更显示出了其局限性。荧光定量PCR（FQ-PCR）是一种新的核酸定量检测技术，其具有快速、特异、灵敏、自动化程度高和高通量的特点。本研究拟建立重要目标赤潮藻种类及孢囊的荧光实时定量PCR检测技术：通过PCR扩增克隆测序获取赤潮藻的基因序列，筛选靶基因，再经比对分析设计FQ-PCR引物和Taq Man探针；建立和优化赤潮藻和孢囊DNA提取方法，应用FQ-PCR引物和Taq Man探针进行扩增，并验证扩增的特异性和重复性，建立FQ-PCR的实验室检测技术；通过实验室模拟自然样品，进一步优化DNA制备和扩增条件，并最终将其用于自然样品单种和多种目标赤潮藻的高通量定量分析。项目的完成对目标赤潮藻的监测、预警具有重要科学意义与应用前景。

我国海域存在若干赤潮原因种的隐形种和新纪录种而对赤潮原因种进行正确鉴定是研究、认识和防治赤潮的前提和基础，同时更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的有害赤潮进行预警。目前，鉴定和检测有害藻类的传统方法仍然是基于形态学分类特征的光学显微镜技术。然而，形态鉴定法存在诸多挑战：如许多赤潮藻形态微小，有些种类无细胞壁，识别尤其困难，光镜通常只能鉴定到属，而要将其进一步鉴定到种，常需要进行电镜观察，而电镜样品的制备过程繁锁；有些赤潮藻细胞形态多变，其表观特征易随生活环境和生长阶段发生变化，增加了某一海域自然水体中赤潮种源的鉴定、监控以及赤潮机理研究的难度；赤潮微藻鉴定的经验依赖度高，使得有些赤潮微藻的鉴定成为分类学家的专长。基于此，本项目试图利用荧光定量PCR特异性、灵敏度、自动化程度高的特点，建立我国海区几种重要赤潮目标藻的荧光定量PCR的分析检测技术。.本项目主要研究内容主要包括：（1）分离纯化目标藻种及其靶基因的克隆及测序；（2）特异性引物的设计及特异性验证；（3）FQ-PCR 标准曲线及回归方程的建立；（4）FQ-PCR 检测技术对自然样品的检测应用。研究目标包括：（1）完成重要目标赤潮藻靶基因的克隆，并设计筛选出可用于FQ-PCR检测的特异性引物；（2）建立目标赤潮藻的FQ-PCR检测技术，并对其检测特异性进行验证；（3）对建立的FQ-PCR检测技术的检测性能进行评价，包括其检测稳定性，准确性及实用性进行评价。 通过研究，项目中从我国海区分离纯化了东海原甲藻、剧毒卡尔藻、三叶原甲藻、赤潮异弯藻、锥状斯氏藻，通过克隆测序、特异性探针引物设计、验证、非目标藻干扰检验，建立了它们的荧光定量检测技术，对东海原甲藻的自然样品（细胞浓度介于3.5 × 1000 cells/L —6.5 × 10000 cells/L）检测结果表明FQ-PCR与LM计数和定量结果相当，且无显著差异（P >0.05）,说明建立的方法适于自然样品的检测；剧毒卡尔藻检测范围在1–104 cells/µL细胞之间，适合低细胞浓度样品检测的需求，而三叶原甲藻、赤潮异弯藻、锥状斯氏藻及其孢囊的荧光定量技术对非目标藻均具有较强的抗干扰能力。项目成果对目标藻种群动态分析、孢囊调查研究以及赤潮监测具有重要科学意义与应用前景。