促破骨细胞分化相关基因修饰的骨髓间充质干细胞对磷酸钙骨水泥降解成骨的作用研究

Calcium Phosphate Cement(CPC) is an injectable bone substitute scaffolds materials, despite its advantages such as capable of minimally invasive,sustainable delivery of loaded drug, and growth factors, the clinical application is still limited due to the slow degradation of the materials. Our previous studies have shown that CPC matric mixied with poly(lacticco-glycolic acid)(PLGA) microspheres is an effective way to promote its degradation and osteogenesis. Beside the reason related to the degradation of the PLGA microspheres leaded to a porous struction created, which wll in favor of the ingrowth of osteogenic activity related cells migration, exchange of nutritive materials, the activeties of osteoclast affiliated to PLGA microspheres seem plays an important role which have Not been well clarified. We discovered that the degradation of PLGA up-regulated expression of RANK mRNA in monocyte-derived macrophage and therefore hypothesized that the activating of osteoclasts is the primary step for the promotion of CPC absorption and osteogenesis, by increasing the proportion of endogenous RANKL, sustainable activation of osteoclast will achieve and the material degradation will be promoted. The purpose of the study is to genetically modified bone mesenchymal stem cells(BMSCs) by using either gene transfection technique or RNA interference(RNAi) technology, subsequently, the genetic modified BMSCs will be encapsulted with alginate beads and embed with CPC matric, the in vitro and in vivo experiments will be performed to investigate the impact to the degradation and osteogenesis of CPC.

磷酸钙骨水泥(CPC)是生物安全性好，可载药缓释，可注射成型的多能骨修复材料，但降解缓慢、降解不完全，效果欠佳。将CPC与乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球复合后,其降解成骨性能得到改善，除了PLGA微球水解后在CPC内部形成孔隙网络，有利局部营养作用的原因外，我们前期工作发现可能还与破骨细胞优先对CPC机体中的PLGA进行识别、吸收后，引发破骨细胞与成骨细胞的偶联活动加强有关，类似天然骨代谢过程，其机理有待阐明。本研究据此假设：破骨细胞也是植入材料降解成骨的关键因素，如在材料内部先增强破骨细胞活动，可达到促进CPC的降解成骨作用。研究拟用促破骨细胞分化相关基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)，根据体外实验结果选择最优基因修饰方案后，进一步将基因修饰的BMSCs进行微囊包裹，作为活性致孔剂和CPC复合，利用细胞、动物实验观察其降解、成骨性能，为促进CPC的降解成骨研究提供新的思路。

背景及主要研究内容：磷酸钙人工骨替代材料普遍存在的降解慢、降解有限是亟待解决的关键问题。本研究立足于RANKL-RANK-OPG调控轴系统在骨代谢中的调控机理，利用基因转染技术调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）RANKL、OPG表达水平，探索其调控破骨细胞活动的可行性。通过微流控技术制备海藻酸/BMSCs微胶囊，探索以BMSCs海藻酸微胶囊为制孔剂与骨水泥（CPC）复合的可行性。.重要结果：RANKL基因转染及RNAi 沉默OPG基因技术作用于BMSCs可分别通过上调RANKL、抑制OPG表达量来增加RANKL/OPG比例，以增强破骨细胞活性，对BMSCs自身成骨、增殖分化潜能无明显影响。微流控技术成功制备BMSCs海藻酸微胶囊，以细胞外三维微环境维持BMSCs的存活及增殖活性，并促进其成骨分化与矿化沉积；成功制备了有可注射性、多孔性及较高弹性模量、抗压强度的BMSCs海藻酸微胶囊/CPC复合物。.关键数据：RANKL基因转染BMSCs后3、7、14、21d ， RANKL/OPG蛋白比值较空白组增加1.59、1.76、1.63、1.69倍，观察期内持续增高。RNAi 沉默OPG基因后3、7、14d，RANKL/OPG蛋白表达比例较空白组增高3.7、2.5、1.44倍，增高程度随时间推移下降，至21d OPG沉默组RANKL/OPG比值与空白组无显著差异。通过微流控技术制备BMSCs海藻酸微胶囊后3、6、9d，微胶囊内BMSCs细胞活力与对照组无显著差异，进行成骨分化诱导培养后，微胶囊内BMSCs ALP活性峰值与对照组无显著差异；BMSCs海藻酸微胶囊/CPC复合物可注射挤出率最高达（43.45±0.890）%;不同比例混合物弹性模量为（65.40±11.20）—（181.50±48.87）MPa，抗压强度（1.30±0.29）MPa—（3.10±0.37）MPa; 1.5gCPC/1mlGel BMSCs海藻酸微胶囊/CPC复合物内可见明显的大孔隙，孔隙之间相互连通。.科学意义：1、利用RANKL基因转染的方法对RANKL/OPG的表达干预比使用RNAi沉默OPG的方法更为稳定，作用周期更长，应为首选方法。2、微流控技术是一种可靠、可控的微球制作方式，有可能是一种可定量载细胞/细胞因子缓释颗粒的方法。