色素代谢新基因ABCB6的功能研究

黑素决定着皮肤类型和颜色，体内合成需经过多步骤酶促生化反应来完成，其间受到复杂而精细的调控，其中源于线粒体的RISP、F1F0 ATP酶及抑制素对色素沉着的调控作用倍受关注，但如何调控线粒体外色素代谢通路的机制迄今仍未明了。ABCB6是我们近期发现的一个参与色素代谢的新基因，主要表达于线粒体外膜。ABCB6是否就是连接线粒体内、外色素代谢通路的"桥梁"基因亟待验证。本项目采用分子生物学手段将野生型ABCB6基因、突变型ABCB6基因分别导入黑素细胞以及RNAi抑制黑素细胞ABCB6基因，研究这些细胞内黑素含量、线粒体外相关因子（TRY、TYRP1、OCA2等）及线粒体内相关因子（RISP、F1F0 ATP酶等）表达水平的变化规律；运用酵母双杂交技术与免疫共沉淀法筛选与ABCB6作用相关蛋白，最后阐明ABCB6的可能作用通路，完善对色素代谢系统的认识。

ABCB6是本课题组基于一个五代泛发性色素异常症家系率先鉴别、与色素代谢相关的新基因。为深入研究其功能，首先成功构建野生型表达质粒pEGFP-ABCB6和突变型ABCB6表达质粒[pEGFP-ABCB6(p.Ser170Gly)]，采用Lipofectamine 2000试剂盒将这些质粒分别转染鼠B10BR黑素细胞，同时设置B10BR细胞非转染组和pEGFP空载体转染组做对照，结果发现：Real-time PCR法检测四组转染黑素细胞TYR、TYRP1、OCA2和RISP等黑素代谢相关因子mRNA表达水平差异不甚明显，Western blot法检测四组转染黑素细胞TYR、OCA2和RISP等关键因子蛋白表达水平差异不大，NaOH裂解法测定的突变体转染组B10BR细胞黑素含量略低下。应用RNA干扰（RNAi）技术沉默黑素细胞ABCB6基因表达，其TYR、OCA2和RISP等相关因子mRNA表达水平、蛋白表达水平差异与ABCB6过表达组结果类似。随后将野生型和突变型pEGFP-ABCB6分别转入鼠B16细胞，同时加入DAPI和GalT等特异性细胞器标记，采用共聚焦显微镜进行亚细胞定位观察，结果发现：野生型ABCB6均匀分布于细胞核周围，突变型ABCB6则聚集于高尔基体内。而与黑素代谢相关蛋白分别进行亚细胞共定位研究时发现：TYRP1与突变型ABCB6一起滞留于核周高尔基体，而不能正常定位于黑素小体，提示突变型ABCB6可能干扰TYRP1的转运。与TYRP1转运通路关键蛋白分别进行亚细胞共定位观察，结果发现：野生型和突变型ABCB6均与关键蛋白Rab32/38存在共定位。采用免疫共沉淀技术亦证实：ABCB6可与Rab32/38蛋白发生相互作用。最后运用酵母双杂交技术进行验证发现：与ABCB6作用相关的靶蛋白就是Rab32/38。这些结果充分表明：ABCB6通过与转运蛋白Rab32/38相互作用，参与TYRP1在高尔基体的转运活动，进一步完善了对黑素代谢系统的认识，具有重要的学术价值。