蔗糖异构酶分子催化机制及应用于产物特异性改造的研究

异麦芽酮糖醇是近年来新兴的一种功能性甜味剂，在崇尚绿色健康的背景下，异麦芽酮糖醇以其低热量、低稀释性和纯正的口感，受到了食品界的广泛关注。本课题以异麦芽酮糖醇合成的关键酶-蔗糖异构酶（SIase）为研究对象，针对该酶产物特异性上的不足，开展SIase分子催化特异性机理的研究，在此基础上进行酶分子改造，获得理性构建具有理想产物特异性的SIase突变体的方法，促进异麦芽酮糖醇生产技术的发展，并为类似糖基转移酶产物特异性的研究提供借鉴，具有重要的学术意义和实用价值。

本项目就计划书中提出的研究目标，严格按照研究计划和方案进行，有针对性地开展了蔗糖异构酶纯化与性质、分子催化特异性机制与酶分子改造的研究。取得了如下成果：1）从Erwinia rhapontici NX-5中分离纯化获得电泳纯蔗糖异构酶（SIase）蛋白，对其酶学性质进行了全面的考察。2）在大肠杆菌中实现了SIase的高效异源表达，纯化获得高浓度电泳纯SIase蛋白，通过晶体筛选获得高质量的SIase单晶，采用X-衍射技术获得自有SIase的晶体结构（PDB code：4HOW）。3) 在此基础上，获得SIase NX5失活突变体E295Q与底物蔗糖的共结晶（PDB code：4HPH），通过共结晶解析提出SIase异构蔗糖可能的催化机制。通过与海藻酮糖主产型SIase底物复合物结构比对得出: 不同类型SIase活性中心与果糖基结合力的强弱不同，影响蔗糖水解后果糖基的互变异构率，进而影响酶的产物选择性。4）分别采用两种不同的策略进行SIase产物选择性改造，结果表明酶催化温度显著影响SIase的产物特异性，突变体SIase K419P，酶反应最适温度提高至35°C，产物中异麦芽酮糖含量上升至87.0±1.5%，异麦芽酮糖与海藻酮糖比例由原始酶的5增加至8.28；其次通过2PWE (SIase NX-5 E295Q与蔗糖复合物)和4HPH (MutB E254与蔗糖复合物)结构的详细比对，发现催化口袋进口处loop330-339在两种不同产物类型SIase中差异显著，对自有SIase进行该loop结构的改造发现酶催化产物中海藻酮糖的比例显著上升至44%，产物选择性发生较大的改变。5）采用分子动力学计算对SIase产物特异性机制进行了初步解析，分别建立了“酶与产物结合自由能”、“催化中心与底物成键原子平均距离”两套较新的数学分析策略，实现了对SIase产物选择性机制较为准确的认识。.本项目已发表论文16篇，其中期刊论文14篇（SCI论文9篇），国际会议论文2篇；获得国家发明专利2项，申请1项；培养博士生1名，硕士生2名；完成了指标要求的任务。