蔗糖异构酶催化机理研究

作为蔗糖的一种异构体，异麦芽酮糖具有许多独特的生理功能，受到广泛关注。其生产主要是通过蔗糖异构酶转化蔗糖进行的，而反应中生成的海藻糖以及少量的葡萄糖和果糖，严重影响了异麦芽酮糖的得率。目前对蔗糖异构酶催化反应的分子基础仍然不清楚，所以无法获得转化产物单一的酶，使得异麦芽酮糖的应用受到了限制。本项目以前期筛选得到的产蔗糖异构酶菌株Klebsiella sp. Strain LX3为研究对象，分析其产酶诱导条件，阐明影响蔗糖异构酶转化产物组成的因素，同时以大肠杆菌异源表达的蔗糖异构酶基因作为一个整体，采用DNA shuffling的方法，构建蔗糖异构酶突变体库，从中筛选得到异麦芽酮糖为单一转化产物的克隆株。通过改组前后酶分子的性质、DNA序列以及推测的蛋白质结构的对比分析，找到转化产物决定因素，阐明酶催化产物特异性的分子基础。本项目的开展将为异麦芽酮糖的生产奠定基础，具有重要的理论和实践价值。

因为异麦芽酮糖具有蔗糖无可比拟的特性，可以广泛用于儿童食品、保健食品、糖尿病人食品和运动饮料，所以越来越受到世界各国消费者的欢迎。我国的异麦芽酮糖产品主要依赖进口，国内生产基本属于空白，因此具有巨大的市场开发潜力。迄今为止发现的微生物蔗糖异构酶，转化蔗糖生成的产物既包含异麦芽酮糖，也包含一定量的海藻糖，还有微量的葡萄糖和果糖，使异麦芽酮糖的生产成本居高不下。要打破这一生产限制，就要搞清楚蔗糖异构酶催化蔗糖转化的分子基础，从而通过各种现代生物学技术，构建转化产物单一的基因工程菌以满足生产的需要。.我们首先研究了蔗糖异构酶生产的诱导条件，主要包括蔗糖异构酶的蔗糖诱导浓度和时间，有机氮源的种类以及pH。然后研究不同的蔗糖异构酶形态如胞内酶、细胞碎片酶、融合酶、胞外酶与蔗糖转化产物间的关系。结果发现最初认为的“蔗糖异构酶催化蔗糖转化的产物与酶的存在形态紧密相关，空间障碍是决定产物比例的重要因素”这一设想是不正确的。因为来源于同一个野生菌的蔗糖异构酶基因在不同的表达系统中表达的不同形态的酶转化产物组成差别不大。因此应该继续以蔗糖异构酶基因（包括信号肽）为基础，从基因整体进行改造，才能得到转化产物单一的基因工程菌。.同时，研究发现蔗糖异构酶转化蔗糖产物的组成与反应时间有关系，当蔗糖转化完全时，异麦芽酮糖的含量最高，继续延长反应时间，异麦芽酮糖会被该酶缓慢转化为海藻酮糖和单糖，这是由于催化反应中部分步骤的可逆性造成的。