基于慢病毒载体转染HCN4通道基因探讨参附注射液动员MSCs重建窦房结起搏功能的研究

Sick sinus syndrome(SSS) is a frequent clinical syndrome, which have a great health hazards to human. Although there has been a great success in implantation of permanent artificial electric cardiac pacemaker，there are still many defects,lack of good, effective drug treatment.Biological pacemaker is a hot topic,but the mechanism remains unclear.Here we study the ability of mesenchymalstemcells(MSCs)as delivery platforms which have been loaded with specific genes to reconstruct biological pacemaking function in vitro and in vivo experiments，combining with cell patch-clamp technique, western-blot, RT-PCR techniques，based on the mechanism of HCN4 channel genes in the pacing function.Shenfu Injection has a good clinical efficacy on SSS.Our previous study found that Shenfu Inject can improve injured sinus node pacemaker function,and its mechanism may increase HCN4 gene expression to some extent.This study will focus on the mechanisms of Shenfu Inject mobilizing bone marrow mesenchymal stem cells to reconstruct the sinus node pacemaker function from the perspective of HCN4 gene family,discovering therapeutic targets and effective drugs of SSS,strengthening the efficacy of the mechanism of traditional Chinese medicine,exploring a new way of prevention and treatment of sick sinus syndrome.

病窦综合征是危害人类健康的常见病，虽然起搏器治疗已获得很大成功，但目前仍有诸多缺陷，缺乏理想、有效的药物治疗。生物起搏是目前研究热点，但机制尚不清楚。基于对 HCN4通道基因在心脏起搏中的作用机制，本课题以慢病毒载体修饰HCN4基因转染骨髓间充质干细胞技术为平台，结合细胞膜片钳技术、westren-blot、RT-PCR 等技术，对骨髓间充质干细胞重建窦房结起搏功能的作用及其机制进行研究。参附注射液治疗病窦综合征在临床上取得良好疗效，我们的前期研究发现参附注射液具有改善损伤窦房结起搏功能的作用，同时观察到其可能机制与提高HCN4基因表达有关。本课题将从HCN4通道基因角度，对参附注射液动员骨髓间充质干细胞重建窦房结起搏功能进行作用机制研究，发掘病窦综合征的治疗靶点及有效药物，为病窦综合征的防治探索一条新的思路和途径。

病态窦房结综合征 (SSS) 是一种复杂的心律失常，严重威胁人类健康。参附注射液（SFI）是一种可有效改善缓慢性心律失常中成药，但其治疗的潜在机制却少有系统的研究。本研究的目的是通过检测SFI 是否可以提高骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 向起搏器样细胞的分化，以及将这些细胞移植SSS的兔模型上是否可以改善窦房结的起搏功能。另外，提取新西兰兔的骨髓间充质干细胞进行体外培养。流式细胞仪用于鉴定CD29、CD44、CD9和CD105表面标志物的表达。全细胞膜片钳法检测HCN4通道电流激活曲线。采用甲醛湿敷法建立SSS兔模型，将经SFI处理的BMSCs移植到SSS兔模型的SAN中。我们检测了体表心电图的变化并记录了其动态变化。此外，对移植了SFI处理的BMSCs的窦房结组织进行HE染色、TUNEL染色、qPCR、WB、免疫荧光、免疫组化和Elisa试验。我们的结果表明，将 SFI处理的BMSCs移植到SSS兔的窦房结中可以改善其起搏功能。体外数据表明SFI可诱导BMSCs增殖，增强其分化为起搏器样细胞的能力，增加BMSCs中HCN4蛋白的表达。在体内实验中，经SFI处理的BMSCs移植在SSS兔中提高了其窦房结的功能，提高了HCN4基因和缝隙连接蛋白（Cx43和Cx45）的表达，与SSS模型组相比效果显著，并且参附注射液组SAN中cAMP 的表达增高了。综上所述，本研究证明SFI可能增强BMSCs向起搏器样细胞的分化能力，从而为生物起搏器的开发提供了一种新方法。此外，我们证实了从骨髓间充质干细胞分化而来的起搏样细胞在改善窦房结起搏功能方面的有效性和安全性。