基于功能核酸的蛋白质翻译后修饰荧光成像分析

Protein post-translational modifications (PTs) are of critical importance in many life activities. Intracellular imaging of PTs in real time inside live cells is a great challenge in analytical chemistry, with very slow progress in a long time because of the difficult in distinguishing proteins or peptides of the same sequences with or without PTs. The applicant proposes to develope a new method based on chemically modified functional DNA by rational design and modified in vitro selection, to obtain functional DNA sequences that are selective and sensitive to peptides or proteins with PTs including sulfation, succinylation and S-nitrosylation. Furthermore, it is also proposed to use these functional DNAs to construct sensors compatible with biological samples, to investigate real-time fluorescence imaging of PTs insdie live cells.

蛋白质翻译后修饰在众多生命过程中都起着至关重要的作用。细胞内蛋白质翻译后修饰的实时成像分析极具挑战，相关研究一直进展缓慢，因为不仅要区分细胞内翻译后修饰的蛋白质与其他分子，还要区分含有后修饰与否的同种蛋白质。申请人拟建立发现含有化学修饰的功能核酸的新方法，通过合理设计和开发新体外筛选技术，获得能对多肽或蛋白质翻译后修饰（硫酸化、琥珀酸化、亚硝基化）进行高选择性、高灵敏度识别的功能核酸。进而，将利用这些化学修饰的功能核酸开发与细胞相容的荧光传感器，探索对细胞内蛋白质翻译后修饰进行实时成像分析。

环境监测和生命分析都需要性能优越的探针分子来对目标分析物进行高选择性高灵敏度的精准分析。功能核酸作为一类具备选择性和灵敏度优势的识别分子，在分析化学和化学生物学研究中受到广泛关注。从体外筛选技术发现的功能核酸序列，其活性和功能受到天然核酸化学结构的局限，因此，对功能核酸进行化学修饰，有望提高其分析化学性能并赋予其更加灵活的响应机制用于精准分析和调控。.我们在本项目执行期中：（1）开发了特色的基于硫代核酸的化学修饰方法，其优势在于可普适于将多种化学官能团引入到核酸中，且易于实施。我们通过该方法，将活性氧响应基团引入功能核酸得到活性氧激活的脱氧核酶，将光敏基团引入功能核酸得到光激活的凝血酶适配体抑制剂，将荧光修饰引入tRNA得到微生物tRNA中天然存在硫代碱基的高效定量分析方法。（2）通过所合成的活性氧激活的脱氧核酶，我们实现了用化学修饰的脱氧核酶在活细胞内正交响应不同的活性氧（过氧化氢和次氯酸），从而使得细胞内的成像分析和基因调控能被与疾病密切相关的活性氧所控制，以提高分析和调控的精准度。（3）通过在铀离子脱氧核酶的关键位点引入低位阻连接体，我们显著增强了脱氧核酶的活性，并用基于此的荧光探针将铀离子检测灵敏度提高了一个数量级。.上述研究结果，为化学修饰功能核酸提供了独特而强大的方法基础，并通过活性氧响应的脱氧核酶研究作为案例证明化学修饰对于核酸工具的重要意义。基于本项目研究提出的方法和策略，将为核酸工具，包括功能核酸、小干扰RNA、CRISPR-Cas9的向导RNA等，提供更加丰富的功能，为更加精准的生命分析和基因调控研究铺平道路。