基于大环多胺类化合物调控的酶催化有机合成反应：机制与反应工程研究

The substrate engineering, protein engineering and immobilization technology were used to continue to study on the molecular mechanism and reational application of enzyme-catalyzed organic reaction based on the regulation of macrocyclic polyamines. Firstly, The compounds containing macrocyclic polyamines or azoles were synthesized as the reaction substrate in lipase-catalyzed hydrolysis. By the the kinetic data obtained from experiments, we could confirm if the leaving groups (macrocyclic polyamines or azole) could affect the affinity between enzyme and substrate and further the enzyme-catalyzed performance. Secondly, the molecular dynamic simulation and site-directed mutagenesis technology were used to design and mutate the enzyme sites which could form hydrogen bonds with macrocyclic polyamine. The mutated enzymes were then used in the reaction system containing macrocyclic polyamine and the catalytic performance of the mutation enzyme were observed. It could be concluded that if these formed hydrogen bonds could make some effects on the bonding between enzyme and substrate and stabilizing the "open" configuration of enzyme. Thirdly, the macrocyclic polyamine and enzyme were co-immobilized using siliceous mesocellular foams as carriers to construct a novel,efficient and reusable immobilized enzyme. It could enhance the practicability of the regulating enzyme-catalyzed performance by macrocyclic polyamine. The experiment and theory methods which were established to study the regulation of enzyme-catalyed reaction by macrocyclic polyamine in the project could provide the studying strageties for other additives.

本项目拟采用底物工程，蛋白质工程和固定化技术继续对大环多胺化合物调控酶催化有机反应的分子机制和合理应用进行研究。首先合成含大环多胺或唑类的底物分子，应用到脂肪酶催化水解反应中，通过动力学和热力学实验研究，来研究底物分子中的大环多胺或唑类离去基团，是否会通过影响酶与底物的亲和作用，从而影响酶的催化性能。然后综合使用分子动力学模拟和定点突变技术对酶活性部位与大环多胺化合物形成氢键的氨基酸位点进行定点突变，以打破这些氢键，观察突变酶在大环多胺反应介质中的催化性能，来研究形成的这些氢键对大环多胺分子与酶的结合以及维持酶的"open"构象的贡献。最后以无机介孔硅材料为载体，对大环多胺化合物和酶进行共固定化，构建出一种新型高效的且可重复使用的复合固定化酶，增强大环多胺化合物调控酶催化性能的实用性。本项目所建立的研究大环多胺调控酶催化有机反应的实验与理论方法，可以为其它添加剂的研究提供思路。

酶催化不对称有机合成反应中，常因底物本身的一些独特的性质，酶的催化活性和立体选择性不是很理想，有目的地引入某种添加剂，可以改变酶分子所处的微环境条件，提高酶的催化性能，但存在着一定的局限性和盲目性，限制了添加剂调节酶催化有机合成反应的基础理论的发展和应用。 .本项目基于利用大环多胺类化合物可以有效调控酶催化有机合成反应的前期工作，采用底物工程，蛋白质工程和固定化技术对大环多胺化合物调控酶催化反应的分子机制和合理应用进行研究，取得一些研究成果：1）采用底物工程策略，发现底物分子中的大环多胺离去基团，确实可以影响酶与底物的亲和作用，从而影响酶的催化性能；采用酶工程策略，将富胺分子嫁接到酶分子上，获得的重组酶同样可以显著提高酶的催化性能，为酶催化有机合成反应的合理调控提供新思路。2）采用蛋白质工程技术，对酶活性部位与大环多胺及底物分子形成氢键相互作用的氨基酸位点进行定点突变以加强或减弱氢键相互作用，发现强化酶-底物-添加剂三者间的氢键相互作用，有助于优化酶催化反应，对其它酶催化反应类型同样适用。3）以无机介孔硅材料为载体，构建出一种基于大环多胺化合物调控的新型固定化酶；采用生物仿生固定化技术，将经富胺分子修饰的重组酶直接实现快速固定化；制备的固定化酶具有较好的催化性能及稳定性，增强了多胺分子调控酶催化有机反应的实用性。本项目已发表标注SCI收录研究论文8篇，获得国家发明专利1项，申请国家发明专利1项。.本项目综合采用底物工程，蛋白质工程和固定化技术对大环多胺化合物调控酶催化有机反应的分子机制和合理应用进行研究，属本课题组创新性工作，可以为其它酶催化有机合成反应的有效调控提供新思路；所建立的基于氢键活化策略“理性定制”酶催化有机合成反应的研究策略，具有通用性，可以极大降低添加剂选用的盲目性。