cfr介导的葡萄球菌对利奈唑胺耐药形成的分子机制、传播机制及适应性代价研究

The novel antibiotic linezolid is the last resort agent for the treatment of serious infections caused by methicillin resistant staphylococci. Our previous stduy indicated that cfr-mediated linezolid-resistant staphylococci isolates had imerged in hospital. To demonstrate the hypothesis of "the cfr gene plays an important role in the resistance and transmission of linezolid, and it is important for the spread of linezolid-resistant staphylococci that the fitness changes after acquiring cfr gene.", linezolid-resistant staphylococci strains are collected from multicenter in China. Firstly, the cfr gene is transformed into S. aureus RN4220, MRSA prevalent clones and other staphylococcus species. The MICs of linezolid against recombination strains are determined by E-test to prove the role of cfr gene in the formation of linezolid resistance. Secondly, to clarify the molecular mechanism of transmission of cfr-mediated linezolid-resistant staphylococci, the genetic environment of cfr and population structure of plasmid harboring cfr gene were analyzed by MLST, southern blot, plasmid sequence and plasmid stability test. Thirdly, the fitness cost of the cfr recombination strains is determined by Competition growth to evaluate the efficiency of maintenance and dissemination of the resistance. This study will provide the important basis for prevention and control of cfr-mediated linezolid resistant-staphylococci.

新药利奈唑胺是治疗多重耐药细菌甲氧西林耐药葡萄球菌（MRSA、MRCNS）的有效药物之一，我们前期研究发现医院内已出现少量cfr介导的利奈唑胺耐药葡萄球菌。为证实"cfr在葡萄球菌对利奈唑胺耐药形成和传播中发挥重要作用，葡萄球菌获取cfr后的适应性变化是其广泛传播的重要条件"这一假设，本项目选取全国多中心分离的携带cfr的利奈唑胺耐药葡萄球菌，通过分子克隆将cfr转化入金葡受体菌RN4220和MRSA流行克隆株及其他种类葡萄球菌，表型分析验证cfr在利奈唑胺耐药中发挥的作用；通过MLST、southern杂交、质粒测序、质粒稳定性试验等，分析cfr周围基因环境及质粒种群结构，阐明cfr的传播机制；通过竞争生长试验等分析cfr重组菌株的适应性代价，从而鉴定cfr耐药性的保持及传播效力，预测cfr是否会在MRSA流行克隆中播散。通过以上研究，为控制cfr介导利奈唑胺耐药葡萄球菌的播散提供依据。

利奈唑胺是治疗多重耐药革兰阳性菌的重要抗菌药物之一，目前，利奈唑胺耐药的葡萄球菌已经在我国医院中出现。本项目收集全国6个城市9家医院分离的43株利奈唑胺耐药的葡萄球菌和16株利奈唑胺耐药的肠球菌，对其耐药机制、传播机制和适应性代价进行了研究。首先，我们调查了以上菌株利奈唑胺耐药基因cfr、optrA及靶位23S rRNA突变情况，结果表明，我国利奈唑胺耐药的葡萄球菌大部分菌株携带cfr耐药基因，cfr是葡萄球菌对利奈唑胺耐药的主要机制，而optrA是肠球菌对利奈唑胺的主要耐药机制。S1核酸酶-PFGE-Southern Blot表明cfr位于质粒上，因此，我们提取了cfr阳性菌株的质粒并进行测序和生物信息学分析。结果表明一部分菌株cfr基因两侧被IS256样插入序列环绕，另一部分菌株cfr插入到转座子Tn558中，插入序列和转座子介导cfr的传播。同时，我们下载了NCBI genebank中所有质量较高的含cfr的DNA序列进行分析，50株cfr阳性菌株的序列分为5大群，每一群有其独特的质粒种群结构，大部分菌株cfr基因两侧存在插入序列或位于转座子上。系统发育分析表明，全球范围内cfr在动物和医院环境之间广泛传播，动物可能是cfr的储蓄池。optrA基因通常侧翼插入序列或转座子，这可能介导optrA在不同菌种或菌株之间的传播。 fexA、ermA1和optrA的共定位表明耐利奈唑胺肠球菌可以通过其他抗生素如大环内酯类等进行选择，应该在临床实践中给予更多关注。一株科氏葡萄球菌质粒上携带cfr基因，MIC值为128mg/L，经质粒消减之后，MIC值降为2mg/L；一株表皮葡萄球菌质粒上携带cfr基因，MIC值为64mg/L，经质粒消减之后，MIC值降为2mg/L。由此可见，cfr基因在葡萄球菌对利奈唑胺耐药中发挥重要作用。体内外竞争生长显示获得cfr的葡萄球菌适应性略有下降，说明适应性代价不大，在一定条件下，cfr可以在葡萄球菌中传播。本研究对于预防控制利奈唑胺耐药菌株在医院环境中的传播具有重要科学意义。