二元调控子VraSR在万古霉素低水平耐药金葡菌形成中的表达调控分子机制研究

万古霉素敏感性下降的金葡菌（hVISA/VISA）给金葡菌感染治疗带来严峻挑战，二元调控子VraSR在hVISA/VISA耐药中发挥重要作用，但其具体调控机制还不清楚。我们在前期研究基础上首先通过调控基因（vraS、vraR）敲除、野生株与缺失突变株的比较表达谱分析验证VraSR调节murZ、pbp2、sgtB、fmt等细胞壁合成相关基因，以及寻找其他被调节基因；其次，采用LacZ报告基因融合、引物延伸、凝胶阻滞、DNase I足迹等研究VraSR对细胞壁合成相关基因的精细调控机制；最后，采用分子克隆、RT-PCR及上述实验研究临床菌株中vraSR的遗传变异对细胞壁合成相关基因表达的影响，探究调控子-靶基因调控环路的重塑在hVISA/VISA耐药产生中所起的作用。从而全面阐明金葡菌VraSR表达调控的分子机制，明确hVISA/VISA耐药机制，为寻找对抗hVISA/VISA靶位点提供线索。

VraSR是调节金黄色葡萄球菌万古霉素低水平耐的二元调控子之一。本项目选取1株临床分离的异质性万古霉素中介耐药金葡菌（hVISA）B6D和1株万古霉素中介耐药金葡菌（VISA）D7，采用同源重组的方法成功构建B6D和D7的vraSR缺失突变株B6D-ΔvraSR和D7-ΔvraSR，并成功构建B6D的vraSR回补株B6D-c。耐药表型分析显示vraSR缺失突变株糖肽类MIC值显著下降，回补株糖肽类MIC值回升，这表明VraSR与金葡菌万古霉素低水平耐药密切相关。电镜结果显示，vraSR野生株、缺失突变株、回补株的细胞壁厚度未发生明显变化。采用RNAseq进行了vraSR野生株、缺失突变株、回补株的比较转录组学分析，与野生株D7相比，vraSR敲除突变株D7-ΔvraSR有26个基因表达显著上调，55个基因表达显著下调；与野生株B6D相比，vraSR敲除突变株B6D-ΔvraSR有103个基因表达显著上调，73个基因表达显著下调；与回补株B6D_c相比，vraSR敲除突变株B6D-ΔvraSR有289个基因表达上调，526个基因表达下调。以上3组共同同向差异表达的基因有15个，均表达下调，包括膜蛋白、FmtA蛋白、折叠酶蛋白PrsA、荚膜多糖生物合成糖基转移酶、VraR、VraS、TcaA蛋白和8个假设蛋白。qRT-PCR证实the membrane protein、fmtA、prsA、capsular polysaccharide biosynthesis glycosyltransferase、tcaA、vraS、vraR在2株vraSR敲除株中均表达下调。EMSA实验证实His-VraR对prsA具有直接的相互作用，且这种相互作用是特异性的。DNaseI足迹实验证实VraR对prsA的结合位点位于-84~-109范围内。说明VraR对prsA具有直接的调控作用。vraSR遗传变异分析表明hVISA菌株中vraS基因发生一些突变，这些基因突变与hVISA万古霉素低水平耐药相关。qRT-PCR检测4对VSSA和hVISA vraS的表达水平，结果显示，与VSSA相比，vraS在hVISA中均表达上调。这表明vraS突变影响了vraS的表达水平，vraS高表达与万古霉素低水平耐药相关。本项目共发表SCI文章4篇，1篇SCI文章审稿中，会议文章5篇。