肠球菌对利奈唑胺的新耐药机制研究

The linezolid resistance against enterococcus spp was an important healthcare problem in the world. It was reported that mutations in 23SrRNA and ribosomal proteins L3/L4 and the acquired resistance cfr gene were the three main resistance mechanisms associated with linezolid resistance. However, some studies have observed that some enterococci displaying elevated MIC results for linezolid did not show any mutations or presence cfr; most of these isolates were collected from China.. In our previous study, a linezolid-resistant Enterococcus faecalis without reported resistance mechanisms was isolated and conjugation experiment was successful, which indicated that a new transferable resistance gene may be associated with linezolid resistance. In this program the plasmid of the conjugate will be sequenced completely and candidate gene will be cloned into shuttle vector to study the new resistance gene. Moreover, in order to study the epidemiology and transferable mechanism of the new resistance gene in China, PCR will be performed to study the distribution of this gene in enterococcus spp in China; genetic diversity of the positive isolates will be determined by PFGE and MLST; S1-PFGE and Southern blotting and sequence analysis will be used to confirm the location and the gene environment.This program will reveal the linezolid resistance mechanism in depth and provide the important basis for risk assessment and control of spread of the resistance gene.

利奈唑胺耐药肠球菌的出现与流行对公共卫生和临床的潜在危害引起人们的高度关注。已报道的耐药机制有三种：核糖体23SrRNA、L蛋白突变、cfr基因，然而近年来未检出上述机制的利奈唑胺肠球菌逐渐被报道，尤其在中国这类菌株较多。. 我们前期研究已获得不含已报道机制的利奈唑胺耐药肠球菌并且通过质粒传递实验成功获得接合转移子，提示有新的利奈唑胺耐药基因并且该基因可以水平传播。本项目通过对接合子的质粒全序列测定以及基因克隆技术研究介导利奈唑胺耐药的新基因；通过PCR技术筛查该基因在我国肠球菌的流行现状，应用PFGE技术和MLST研究阳性菌株的亲缘性关系，采用S1-PFGE和Southern blot杂交定位、介导该基因转移的遗传元件结构图绘制及解析来探明该新基因在我国肠球菌的流行和传播机制，上述研究能更全面揭示利奈唑胺的耐药机制，为耐药基因的转移扩散的风险评估和防控提供重要科学依据。

利奈唑胺是治疗万古霉素耐药肠球菌、甲氧西林耐药葡萄球菌等难治性感染的有效药物，利奈唑胺耐药菌株的出现引起国内外广泛关注，研究利奈唑胺的耐药机制具有重要意义。本研究以前期研究中发现的3株利奈唑胺耐药肠球菌为研究对象，与其他课题组合作发现了介导利奈唑胺耐药的新基因optrA。随后以我国2004-2018年度临床分离的3592株肠球菌为研究对象，研究了该基因的流行特征，探索了其传播机制。结果显示：14年间，optrA基因的整体检出率为2.3%；optrA的整体检出率呈上升趋势，由2004-2005年度的0.4%上升到2017-2018年度的2.7%，2013-2104年度的检出率最高，为3.9%；该基因在粪肠球菌中的检出率高于屎肠球菌。脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型结果显示携带optrA菌株的同源性较低，克隆型较分散。S1-PFGE&Southern blot结果表明optrA基因既可位于质粒也可位于染色体，并且质粒携带菌株数多于染色体携带的菌株数。质粒接合传递实验显示optrA基因可以水平传递。对部分菌株进行了全基因组测序和生物信息分析，结果显示粪肠球菌携带optrA的质粒与首次报道的optrA质粒pE349相似；6株粪肠球菌的质粒与已报道的optrA质粒p10-2-2相似，在optrA基因的侧翼存在插入序列IS1216E，而位于染色体的optrA基因的环境则多与已报道的菌株E016或G20类似。屎肠球菌的optrA基因的环境与已报道的粪肠球菌E016或G20相似相似；1株泰国肠球菌和1株鹑鸡肠球菌的optrA侧翼序列结构与粪肠球菌E016相似，这提示optrA基因可能在不同菌种间传播。另外我们还对2015年以来新报道的其他利奈唑胺耐药基因cfr(B)、cfr(C)、poxtA基因以及经典的耐药基因cfr进行了研究。结果显示未发现cfr、cfr(C)阳性菌株；检测到1株cfr（B）阳性的屎肠球菌;筛查到poxtA基因阳性的菌株。与optrA基因类似，poxtA编码的氨基酸序列也属于ABC转运蛋白家族，2018年报道。与optrA基因比较，poxtA基因的检出率低于optrA基因，整体检出率为0.3%；并且与optrA基因不同，屎肠球菌中poxtA基因的检出率高于粪肠球菌，分别为0.5%、0.1%。本研究对于全面了解利奈唑胺耐药基因的流行特征和传播情况具有一定意义。