飞蝗细胞色素P450基因鉴定及基于RNAi的农药代谢特性研究

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布于生物体中的代谢酶系，在解毒外源物质和合成内源物质中起重要作用，目前对飞蝗细胞色素P450尚缺乏系统研究。基于飞蝗的EST数据库平台，本实验室获得15条P450基因部分片段，并比较了其在飞蝗不同组织和龄期的表达差异。本项目拟在前期工作基础上，采用RACE技术获得基因全长序列，通过生物信息学方法分析P450基因结构特点，对其进行系统命名和分类；采用原位杂交技术对P450基因的mRNA进行组织定位；异源表达P450蛋白，制备抗体，Western blot分析蛋白表达差异；采用Real-Time PCR技术研究其对常用农药的应答；进一步采用RNA干扰技术研究P450基因的农药解毒特性，获得P450对常用农药的解毒谱。研究结果将丰富昆虫细胞色素P450的理论体系，为基于P450基因的飞蝗有效控制提供科学依据。

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布于生物体中的代谢酶系，在解毒外源物质和合成内源物质中起重要作用。本研究基于大规模测序技术构建了飞蝗转库组数据库，从转录组数据库获得187个细胞色素P450基因片段；采用RACE-PCR技术克隆获得47个细胞色素P450基因，提交国际P450命名委员会命名并与果蝇及赤拟谷盗P450基因进行聚类分析；采用qRT-PCR技术研究了部分细胞色素P450基因在飞蝗不同发育龄期及组织部位的表达特性，表明飞蝗同一家族P450基因表达谱较为相似，同一家族的不同基因在不同组织部位和发育阶段存在差异，显示飞蝗细胞色素P450基因功能发生了分化。采用RNAi技术结合杀虫剂生测实验，结果显示体外注射特异性细胞色素P450基因dsRNA后点滴杀虫剂，飞蝗死亡率从22.9%增加至39.6%-50.0%，细胞色素P450基因参与飞蝗对马拉硫磷，氯氰菊酯、西维因和溴氰菊酯的代谢解毒。其中LmCYP409A1，LmCYP408B1，LmCYP6FF1，LmCYP4G62，LmCYP6EL1，LmCYP9AQ1和LmCYP9AQ2参与对溴氰菊酯的代谢解毒；而LmCYP6FD2，LmCYP6FE1，LmCYP6EL1和LmCYP9AQ1参与西维因的代谢解毒。采用转基因技术构建转飞蝗P450基因果蝇品系，分别点滴毒死蜱、马拉硫磷和溴氰菊酯，表明LmCYP408B1和LmCYP409A1可参与溴氰菊酯的代谢并使得转基因果蝇对溴氰菊酯产生抗药性。利用杆状病毒表达系统获得有活性的P450重组蛋白，利用CO差光谱分析重组P450蛋白活性，采用底物检测重组蛋白代谢活性，GC-MS/HPLC确定重组蛋白在体外对杀虫剂的代谢活性，以揭示飞蝗P450酶对杀虫剂的作用机理。.本项目研究工作按计划完成，发表学术论文18篇，其中SCI引源刊物论文12篇，中文核心期刊论文6篇（见附件），培养博士研究生2名，硕士研究生5名，作为参加人获得“中华农业科技奖”一等奖1项。