结核分枝杆菌蛋白质编码基因Rv2624c功能的研究

作为最成功的病原微生物之一，结核分枝杆菌进化发展了一些烈的保护能力使其能够成功躲避或抵抗宿主免疫系统的威胁。厌氧胁迫和一氧化氮（NO）分别是人和小鼠抵抗结核分枝杆菌侵染得重要手段。本研究在我们已有研究的基础上，对一个结核USP（Universal-Stress-Protein）蛋白编码基因Rv2624c在结核分枝杆菌致病性中的作用进行深入研究。通过利用结核分枝杆菌的基因敲除技术，构建Rv2624c基因缺失的突变体。应用体外细胞学研究技术，分析Rv2624c基因在结核分枝杆菌急性侵染中的作用；通过慢性结核病小鼠模型的研究，分析Rv2624c基因在慢性结核病以及慢性结核复发中的作用机理。通过本课题的研究，可以深化我们对结核分枝杆菌应对宿主免疫胁迫的作用机理，并为今后结核病治疗提供新的技术，为发现新的结核病药物靶标提供更多的信息。

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是最为成功的病原微生物之一，它感染了全世界约三分之一的人口并且每年导致200万病人死亡。通用应激蛋白（Universal Stress Protein，简称USP），是一类在各种应激条件下表达发生变化的广泛存在于各种生命体中的保守蛋白，它在病原体应对不同环境条件变化时起着重要的作用，包括静止生长期、饥饿、DNA损伤、抗生素治疗、氧化呼吸抑制、活化氧及含氮化合物处理等。结核分枝杆菌共有8个USPs，但结核分枝杆菌的USP蛋白具体的功能仍然不是很清楚。前期的研究发现，厌氧及NO胁迫条件下，结核分枝杆菌USP Rv2623、Rv2624c等表达显著上调。通过对Rv2623的研究发现该基因缺失的菌株对小鼠和豚鼠具有比野生型菌株更强的毒力。体外实验也表明过量表达Rv2623可以降低分枝杆菌的生长速度。结核分枝杆菌Rv2624c编码蛋白和Rv2623编码蛋白高度同源，本课题旨在对结核分枝杆菌USP Rv2624c蛋白的功能进行深入研究，并探讨其对结核分枝杆菌耐药性的影响。本研究主要分为以下两个部分：1。结核分枝杆菌USP编码蛋白Rv2624c生物学功能的研究；2。Rv2624c对结核分枝杆菌耐药性的影响。.我们的研究发现，经原核表达并纯化得到Rv2624c编码蛋白质的是一个具有生物活性的蛋白质。体外研究发现Rv2624c不仅能够结合ATP，而且具有弱的ATP水解活性。对关键位点的氨基酸进行突变能显著降低其ATP结合能力，同时显著增强ATP水解活性。通过野生型及突变体Rv2624c转染耻垢分枝杆菌发现其对耻垢分枝杆菌的生长没有影响。因此，Rv2624c的ATP结合能力及水解活性对分枝杆菌的生长及致病力的影响仍需进一步研究。在我们筛选的临床耐多药结核分枝杆菌群体中，通过PCR扩增这些菌株的Rv2624c编码区和embB编码区DNA并进行测序分析，结果在Rv2624c蛋白质编码区未发现有与耐药性相关的突变。而对同一临床菌株群体embB基因的测序分析，则首次显示结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性是一个由多基因多位点协同突变的结果；并获得了3对（6株）embB突变相同但乙胺丁醇耐药性相反的菌株，为进一步筛选鉴定新的乙胺丁醇耐药相关基因和突变打下坚实的基础。这项研究同时还表明我国中部人口密集地区存在广泛耐药结核病的严重威胁。