结核分枝杆菌耐药相关非编码基因区的系统发现和耐药新机制研究

The worldwide emergence of multi-drug-resistant (MDR) and extensively-drug-resistant (XDR) tuberculosis threatens to make this disease incurable. Drug resistance mechanisms are only partially understood, and whether our current understanding of the genetic basis of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis is sufficiently comprehensive remains unclear.Therefore, the mechanism of drug-resistance TB drug discovery and molecular marker need to be established that will be an important foundation for the establishment of a new method for the detection of drug resistance. The project is interested in the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis related coding and non-coding gene region to explore new mechanisms of resistance as the goal, as follows: 1) genome-wide association analysis system for the discovery of new drug-resistance-associated coding and non-coding gene: through the analysis of whole-genome sequencing and comparative genomics to find new drug-resistance-associated coding and non-coding gene; 2) the correlation verification of drug-resistance and the new found drug-resistance-associated coding and non-coding gene: the resistance gene of clinical isolates amplified, sequenced found mutations associated with resistance of these non coding gene region; 3) the functional study of drug-resistance-associated non-coding gene transcript product (non-coding RNA) : The structure analysis of non-coding RNA-protein complexes and by in vivo and in vitro bioactivity asssay to reveal new mechanisms of resistance, and provide an important foundation for the new drug research.

目前结核病疫情严重，耐药的出现使其更加恶化，但耐药机制不清楚导致不能准确、快速检测其耐药性，不能为制定耐药结核病的最佳治疗方案提供重要依据。因此，结核病耐药分子标识物的发现和耐药机制研究将为建立耐药检测新方法和新药研发奠定重要基础。本项目拟以系统发现结核杆菌耐药相关非编码基因区和深入探讨耐药新机制为目标，开展如下研究：1）全基因组关联分析系统发现新的耐药相关基因和非编码基因区：通过全基因组测序和比较基因组学的分析发现新的与耐药发生相关的基因和非编码基因区；2）新发现耐药相关非编码基因区与耐药发生的相关性验证：通过临床菌株的耐药基因扩增、测序发现这些非编码基因区的突变与耐药的相关性；3）耐药相关非编码基因区的转录产物进行功能研究：开展耐药相关非编码RNA与结合蛋白复合物的蛋白结构解析工作，并通过生物功能试验和体内外生物活性实验研究揭示耐药产生的新机制，为新药研发提供重要基础

本项目从三方面开展研究：1. Mtb DNA pol III被认为抗结核药物开发的重要靶点。我们研究发现，发现 Mtb α、ε 和 β 亚基可以形成α-β2-ε复制酶复合物。α和 ε之间并不存在直接的相互作用，而是通过β 亚基发挥了重要的桥梁作用。 2. 生物素是生物体内一些必需酶的辅助因子。生物素合成途径主要分为两部分：一是前体分子庚二酸单酰-CoA（或者庚二酸单酰-ACP）的合成；二是从庚二酸单酰-CoA（或者庚二酸单酰-ACP）到生物素的合成过程，这一过程又可分成四步反应，分别由BioF、BioA、BioD和BioB催化完成。这四步反应非常保守的。本项目获得了MsBioF的蛋白晶体，解析了MsBioF的结构。并且通过两步交换对耻垢分枝杆菌中的MsbioF进行了无标记地敲除，揭示了MsbioF在生物合成途径中具有关键性作用，证明了MsbioF的作用是通过影响生物素依赖蛋白的生物素化来实现的。3. H37Rv 是作为研究结核分枝杆菌的实验室标准菌株，具有毒性；而H37Ra 是其对应的弱毒性菌株。 H37Ra 与H37Rv 在基因组水平有高度的相似性，两个菌株之间仅有198 个SNP，这暗示两个菌株之间的毒力差异可能由转录导致。本项目开发了一种基于高通量测序发现sRNA 的方法。发现883 个长度为40-449 nt 的sRNA。在H37Ra 中发现了962 个sRNA，包括310 个与H37Rv 相同的sRNA，并对其中一个sRNA（ncRv3825A）进行了深入研究。发现ncRv3825A 的靶基因之一是编码聚酮合酶的基因pks2，该基因可能参与脂肪酸代谢途径，结核分枝杆菌脂肪酸与其毒力、逃逸免疫系统攻击等能力有关。与H37Ra 相比， ncRv3825A 在H37Rv 中降低3.73 倍，而pks2 在H37Rv 中升高11.07 倍。过量表达ncRv3825A 会降低pks2 的表达量。此外ncRv3825A 会促进H37Rv 在人巨噬细胞内的生长，暗示ncRv3825A 可能与结核分枝杆菌的毒力或感染有一定关联。随后，在耐药菌种开展研究，B36 是一个药物敏感型菌株，B42 是泛耐药（XDR-MTB）菌株。分别鉴定了646（B42-0）、641（B42-6）和467（B36）个sRNA 候选区，相关实验还在进行。