吡嗪酰胺耐药结核分枝杆菌中pncA基因与蛋白质相互作用研究

Pyrazinamide is one of the most important first-line drugs for M.tuberculosis infection.Its inclusion in isoniazid and rifampin-containing regimens has enabled the shortening of the treatment period. However, the mechanism of M.tuberculosis resistance to pyrazinamide is not so clear.Mutations within the pncA, which encodes the pyrazinamidase, had been described as the major mechanism of PZA-resistance in M.tuberculosis. But, some PZA-resistant isolates without mutation in the gene of pncA. In this project, other related mechanism in M.tuberculosis to PZA will be investigated. For this purpose, we put forward the hypotheses: it may exist some proteins that combine with pncA so that the transcription and translation of pncA was prohibited. The proteins will be captured by the Reverse ChIP and bacterial one-hybrid reporter system from two directions and characterised by the protein mass spectrum technique. After this, the gene of encoding protein will be knocked out to analize its function acted on pncA.And the binding sites between pncA and protein will be deteced by electrophoretic mobility shift assay to reveal the mechanism of M.tuberculosis resistance to PZA. This study is important for fully understanding the mechanism of PZA-resistant tuberculosis and is beneficial to develope PZA drug susceptibility test and design more effective anti-tuberculosis drugs.

吡嗪酰胺是重要的一线抗结核药物之一，当其与异烟肼和利福平联合应用后可明显缩短化疗时间。结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药给结核病治疗带来困难。目前已知的吡嗪酰胺耐药机制为编码吡嗪酰胺酶的pncA基因发生突变，但存在一些结核分枝杆菌的pncA基因无突变依然表型耐药、机制不清。本课题在前期发现的基础上围绕这一现象提出假说：可能存在蛋白质与pncA基因相结合从而抑制其转录和翻译而无吡嗪酰胺酶合成导致耐药。拟利用Reverse ChIP和细菌单杂交技术分别"垂钓"与pncA基因相结合的蛋白，进而用蛋白质谱确定蛋白特性；而后利用基因敲除编码该蛋白的基因，分析该蛋白对pncA基因表达的影响；并利用电泳迁移位移试验确定蛋白质与pncA基因结合的区域。本课题从DNA与蛋白质相互作用的角度探讨结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药的分子机理，对进一步阐明吡嗪酰胺耐药机制、完善耐药临床检测方法、设计合理的治疗药物等具有重要意义。

结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药给结核病治疗带来困难，目前已知的吡嗪酰胺耐药机制主要为编码吡嗪酰胺酶的pncA基因发生突变。本课题对前期发现的2株（NJ44、NJ108）pncA基因及调控序列均未突变的PZA耐药结核分枝杆菌，采用Reverse-ChIP技术和细菌单杂交技术钓取目的蛋白编码基因。研究过程中Reverse-ChIP技术实施不畅。在细菌单杂交技术钓取目的蛋白编码基因部分，由于细菌载体稳定性较差，改为使用酵母单杂交系统钓取目的蛋白编码基因。虽然我们成功构建了诱饵酵母菌株，完成PAbAi-PncA杂交文库构建，但蛋白筛选非常困难，并未获得有价值的蛋白。因此，课题研究内容进行了调整。.研究检测108株结核分枝杆菌临床分离株对一线抗结核药物（包括PZA）药物敏感性，进行 pncA、panD、rpsA基因序列分析。结果显示PZA耐药菌株的pncA基因改变以碱基置换为主，His57Asp氨基酸改变较为常见。pncA基因突变序列分析发现7个新的突变位点。NJ44和NJ108菌株的panD基因和rspA编码基因及上下游序列分析发现NJ108菌株存在panD G419A突变而NJ44无任何突变，二者rpsA基因均为野生型。. 为进一步了解NJ44菌株的耐药机制，进而对NJ44进行全基因组序列分析和RNAseq分析。NJ44菌株全基因组测序的结果，通过分析非同义SNP，发现3个可能与吡嗪酰胺耐药相关的SNP，分别位于fas I、rv2688c和rv1458c基因中。fas I是脂肪酸合成酶编码基因，与结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关。rv2688c基因为结核分枝杆菌中细胞膜上的药物外排泵，能够主动外向转运喹诺酮类抗生素，因此该基因突变也可能与吡嗪酰胺耐药有关。rv1458c基因编码结核分枝杆菌ABC转运蛋白，rv1458c与其下游基因rv1457c和rv1456c基因共同组成了药物外排转运系统，也可能与吡嗪酰胺耐药相关。RNA测序结果与H37Rv标准菌株相比较，发现表达有差异的基因有488个，其中表达上调的有313个，下调的有175个。pncA基因与H37Rv相比较表达上调2.7倍，与预期的下调刚好相反，可能与PZA只在体外酸性环境中发挥抗菌活性有关。综上，本课题初步阐明了NJ44可能的耐药机制，将在后续研究中继续完善功能验证。