NAD激酶的基因组过表达及其调控PHB合成的机制研究

在微生物利用有机质进行生物转化的过程中，辅酶NADPH作为还原力参与了多种生物合成反应，发挥着重要的调控作用。通过基因工程的手段，对细胞内的代谢途径进行改造，增加NADPH的供给，可以提高生物合成反应的效率。我们前期的研究发现，过表达NAD激酶能够提高重组大肠杆菌中聚3-羟基丁酸酯(PHB)的生物合成。在此基础上，我们拟在大肠杆菌中构建DNA片段的多次染色体整合系统，将1-4个NAD激酶基因整合到基因组中，获得遗传稳定的过表达NAD激酶重组菌。在正常生理状态和PHB合成条件下，分别对不同NAD激酶表达水平的细菌中关键蛋白的表达量及酶活、胞内辅酶浓度、发酵产物及产量和PHB的产量等进行研究，解析基因过表达引起的细菌生理学变化，寻找胞内与NAD激酶协同作用的潜在调控位点，从而探索NAD激酶促进PHB合成的机理，为进一步的代谢工程改造和NAD激酶在其他生物合成途径中的应用提供理论基础。

本项目利用噬菌体attB-attP和酵母菌FRT-FLP位点特异性重组技术，构建了能在大肠杆菌染色体中进行多次DNA片段插入的自杀质粒；利用该系统，将多个拷贝的NAD激酶基因插入到大肠杆菌染色体中，获得了遗传稳定的NAD激酶过表达重组菌E. coli T2。没有PHB合成时，过表达NAD激酶对细胞正常生长和代谢没有明显影响，重组菌和野生型表现出相似的生长速度、细胞干重、葡萄糖消耗和乙酸产量。引入PHB合成后，基因组水平过表达NAD激酶的重组菌表现出较强的PHB合成能力，摇瓶培养中PHB产量比对照菌提高了30%，与之前研究中质粒过表达提高16-35%的效果接近。基因转录分析的结果表明，重组菌中PHB合成操纵子的表达提高了6-8倍，可能是PHB合成得以提高的主要因素；糖酵解途径中pgi和gapA的表达分别上调了5.8倍和1倍，表明NAD激酶过表达能强化糖酵解从而提高了葡萄糖利用；磷酸戊糖途径和三羧酸循环中NADPH相关基因的表达没有明显变化，转氢酶pntAB和udhA的表达提高了1-2.5倍，表明NAD激酶过表达时用于PHB合成的还原力主要源于转氢酶的催化作用。本项目研究提供了一种构建遗传稳定过表达NAD激酶重组菌的方法，可以为提高其他辅酶依赖的生物合成反应提供参考。