氧化葡萄糖酸杆菌NAD（P）H氧化酶基因的活性鉴定及其功能和表达调控的研究

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是氧化发酵的创立菌和氧化催化应用最多的微生物之一，然而，该菌在氧化反应和磷酸五糖代谢过程中产生大量的还原型辅酶NAD(P)H，这些辅酶如何进一步被氧化再生，维持细胞的氧化还原平衡是个关键的科学问题。申请者发现该菌基因组存在一个类似NAD（P）H氧化酶基因gox0502，与已知假单胞菌NADH氧化酶氨基酸序列有65%的一致性，预示该酶在细胞中可能负责NAD(P)H辅酶的再生，维持细胞氧化还原平衡。为此，本课题拟通过基因异源表达、实时定量PCR和基因的敲除与互补试验等方法分别研究gox0502基因产物的活性、酶学性质、基因表达调控和生理功能，尤其对整细胞氧化催化的影响。本课题以细胞内辅酶再生机制为研究对象，可能发现氧化葡萄糖酸杆菌一些促进细胞氧化还原反应平衡向氧化方向进行的机制，为进一步提高转化率，加快反应速度打下坚实的理论基础。

按照计划完成了gox0502基因的克隆、E.coli中的异源表达、蛋白纯化及酶学性质的研究。确定了gox0502基因编码的酶（GOX0502）是一个需要FMN、NADH依赖的烯醇还原酶，属于OYE(Old Yellow Enzyme) 蛋白家族中的成员，具有催化不饱和烯醇不对称还原的活性，无NADH氧化酶活力。gox0502基因的表达对氧化葡萄糖酸杆菌的生长基本无影响；gox0502基因的过表达可促进细胞对烯醇底物的还原。. 研究发现氧化葡萄糖酸杆菌中的gox 1675(NADH dehydrogenase type II)编码的蛋白具有NADH氧化酶活力，该酶基因的过表达，既能促进细胞的生长，也有利于细胞中山梨醇脱氢酶、乙醇脱氢酶等酶的表达，从而提高细胞对对醇的氧化活性。. 为了更深入的研究GOX0502蛋白的催化功能，推测其生理底物或类似物，在原计划基础上增加了GOX0502蛋白的结晶以及结构解析的研究内容，获得了其晶体结构，并根据GOX0502的蛋白质三维结构设计点突变位点，初步确定了第172位的组氨酸、第175位的天冬酰胺、第177位的酪氨酸对酶的催化活性有关键的作用，而第100位的色氨酸对底物的空间选择性有重要的影响。. 在完成预期研究内容的基础上，项目执行期间相关研究工作发表了文章6篇，获得了3项授权专利和1项上海市科技进步奖，培养博士2名和硕士4名。