大肠杆菌木糖生物合成乙醇酸和乙醇酸基聚合物的代谢工程研究

Glycolate is the simplest alpha hydroxy acid and could be used in a wide range of chemical, pharmaceutical, textile and metallurgical processes. Glycolate based polymers have excellent biocompatible and biodegradable properties. Currently, glycolate and glycolate based polymers are mainly produced through chemical synthesis. In this study, we propose to construct artificial synthetic pathways for the production of glycolate and glycolate based polymers from xylose in Escherichia coli, and then investigate the biosynthetic processes of target products. A gene expression control element library will be built by the mutation of promoter and ribosome binding sites. Based on the metabolic flux analysis, the critical metabolic pathways will be found out. Thus, the expression level of multiple genes involved in different functional modules could be adjusted to avoid the accumulation of intermediates and lead to the greatest metabolic flux shift to the desired products. Furthermore, the cofactor metabolic pathways will also be engineered and regulated, so that the intracellular redox state could satisfy the needs of target products synthesis efficiency, which could help to obtain the maximum carbon conversion yield and product synthesis. This study will help to obtain glycolate and glycolate based polymers from xylose, and also provide a reference for the synthesis of other multi-enzymatic metabolites, thus indicating high value of both theoretical and practical significance.

乙醇酸是结构最简单的羟基羧酸，在化工、医药、纺织和冶金等领域有广泛应用；乙醇酸基聚合物是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子材料。目前，乙醇酸和乙醇酸基聚合物主要由化学法合成。本项目拟在大肠杆菌中构建木糖合成乙醇酸和乙醇酸基聚合物的组合代谢途径，并对目标产物的生物合成过程进行研究。改造启动子和核糖体结合位点以构建基因表达控制元件库，通过代谢流分析等寻找关键代谢途径，在此基础上对不同代谢模块中多基因的表达水平进行调节，避免中间产物的累积，将代谢流最大限度的转向目标产物。本研究还将对细胞内的辅酶代谢进行调控，使胞内氧化还原水平适应目标产物合成的需要，以获得最高的碳源转化率和产物合成效率。本研究将有助于实现利用木糖获得乙醇酸和乙醇酸基聚合物，也能为其他多酶催化代谢产物的生物合成提供参考，具有重要的理论和现实意义。

乙醇酸是结构最简单的羟基羧酸，在化工、医药、纺织和冶金等领域有广泛应用；乙醇酸基聚合物是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子材料。目前，乙醇酸和乙醇酸基聚合物主要由化学法合成。本项目在大肠杆菌中构建了乙醇酸和乙醇酸基聚合物的合成途径，并对目标产物的生物合成过程进行研究，获得了高产乙醇酸和乙醇酸基聚合物的重组菌株；在木糖合成乙醇酸代谢途径的基础上，构建出高效合成苹果酸的工程菌株。项目取得的重要结果和关键数据有：.（1）构建了木糖为碳源合成乙醇酸的代谢途径，涉及7个基因的过表达和5个大肠杆菌内源基因的敲除，所得重组菌株在发酵罐培养的乙醇酸产量达40 g/L，得率0.63 g/g，为理论值的62%，超过了之前的报道水平（0.45 g/g）。.（2）构建了过表达7个基因的乙醇酸、乳酸与3-羟基丁酸共聚酯的生物合成途径，摇瓶培养的共聚酯产量为3.90 g/L，乙醇酸、乳酸、3-羟基丁酸单体含量分别为16.06 mol%、17.26 mol%、66.68 mol%；对新型共聚酯进行了结构鉴定，测定了物化性能和机械性能。.（3）构建了过表达10个基因的乙醇酸、乳酸、3-羟基丁酸与4-羟基丁酸共聚酯的生物合成途径，发酵罐培养的共聚酯产量为14.29 g/L，乙醇酸、乳酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸单体含量分别为8.17 mol%、16.34 mol%、66.09 mol%、9.40 mol%；在此基础上，对四元共聚酯的结构、物化性能和机械性能进行了表征。.（4）构建了木糖为碳源合成苹果酸的代谢途径，涉及9个基因的过表达和7个大肠杆菌内源基因的敲除，所得重组菌株在摇瓶培养的苹果酸产量为5.90 g/L，得率0.80 g/g，超过理论值的90%，为目前报道的木糖合成苹果酸的最高得率。.综上，本项目成功构建了乙醇酸、乙醇酸基聚合物以及苹果酸的生物合成途径，获得了一系列新型重组菌株，其中乙醇酸和苹果酸在产量以及得率等方面达到较高水平。项目研究也能为其它多酶催化代谢产物的生物合成提供参考，具有重要的理论和现实意义。