Bcl-2/Beclin1相互作用介导脑缺血再灌注自噬机制及其醒脑静拮抗效应

Autophagy regulation is a key issue of anti-ischemic stroke. Xingnaojing was comfirmed as a effective proprietary Chinese medicine for the treatment of acute stroke .The preliminary study found that Xingnaojing can inhibit autophagy, apoptosis and increase antiapoptotic protein Bcl-2. Therefore, we assume: Xing- naojing inhibits autophagy by enhancing the expression of Bcl-2/ autophagy- related protein Beclin1 ,which form a stable complex by interaction. So we will build Beclin1 gene promoter-driven luciferase (Luc) promoter reporter gene system , combined with the DNA-Pull-down with MALDI-TOF/MS technique to observe the activity of the silencer on the promoter , the enhancer binding protein and Beclin1 promoter; Using RNAi technology closure of Beclin1 and Bcl-2,or transfecting with the expression of Beclin1 to PC12 cells,we will observe Xingnaojing effecting autophagy induced by glutamate in PC12 cells through Bcl-2/Beclin1 interaction , and we will investigate Xingnaojing neuro- protective effect and Beclin1 in Bcl-2 expression in cerebral ischemia by autopha- gy inhibitor or autophagy inducer, therefore we will elaborated the scientific connotation of the Chinese medicine "Aromatic medicine opening khieu and refreshing brain".

自噬调控成为抗缺血性中风一个关键问题。醒脑静为治疗急性中风疗效显著的中成药。前期研究发现，醒脑静对自噬有抑制作用，同时抑制凋亡并上调抗凋亡蛋白Bcl-2。因此，我们假设：醒脑静通过增强Bcl-2/自噬相关蛋白Beclin1相互作用，形成稳定复合体而抑制自噬。构建Beclin1基因启动子驱动的荧光素酶(Luc)启动子报告基因系统，结合DNA-Pull-down与MALDI- TOF/MS技术，观察醒脑静对启动子的沉默子和增强子结合蛋白和对Beclin1启动子活性的影响；采用RNAi技术封闭Beclin1和Bcl-2，或转染过表达Beclin1到PC12细胞中，观察Bcl-2/Beclin1相互作用在醒脑静对谷氨酸诱导PC12细胞自噬中的作用；用自噬抑制剂和自噬诱导剂探讨自噬在醒脑静对大鼠脑缺血的神经保护作用和Beclin1、Bcl-2表达。阐述中医芳香开窍醒脑理论的科学内涵

自噬调控成为抗缺血性中风一个关键问题。醒脑静为治疗急性中风疗效显著的中成药。前期研究发现，醒脑静对自噬有抑制作用，同时抑制凋亡并上调抗凋亡蛋白Bcl-2。因此本研究通过研究醒脑静抗脑缺血的作用机制，阐述中医芳香开窍醒脑理论的科学内涵。. 通过观察醒脑静对脑缺血再灌注自噬蛋白表达量的影响，醒脑静可抑制大鼠脑缺血再灌注过程中的自噬反应，提高受损神经细胞的存活率；成功建立用 Beclin1 基因启动子报告基因检测 Beclin1 基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型，血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导 Beclin1 基因启动子的转录活性； miR-574确切调控Nrn1的表达，对5月龄APP/PS1小鼠认知损伤有修复作用；研究发现醒脑静通过抑制p53/DRAM通路，抑制无血清条件下诱导的细胞自噬模型以及大鼠脑缺血模型的细胞自噬。. 本研究通过观察醒脑静对脑缺血再灌注动物模型以及细胞模型的保护作用，并对其分子机制进行了细致深入的研究，研究结果具有相当大的治疗意义，同时为临床脑疾病的治疗提供了一个新的具有开发潜力的药物。在本次基金项目研究中还对AD的发病机制进行了研究，为之后的AD的中药治疗打下理论基础。醒脑静中的有效成分-左旋樟脑能下调 miR-140 表达来抑制细胞的凋亡和自噬，起到神经保护作用，证明醒脑静其组成成分仍然可以继续深入研究，为之后的临床用药提供依据和指导。