醒脑静调控活性氧—自噬交互作用干预脑卒中急性期神经血管单元损伤的机制

ROS and autophagy have an important role in maintaining cell survival and the homeostasis, they can be activated of different degrees in early acute brain injury, such as cerebral hemorrhage and cerebral ischemia. The interaction between ROS and autophagy has become one of the focuses in current stroke research. Clinical practice has proved that Xingnaojing, without restriction of radiological conditions on the treatment, reflects the advantages of early intervention. This study uses two types of animal models, the MCAO model and the cerebral hemorrhage model by injecting autologous blood in brains of rats, combining with neurovascular unit model that nerve cells, glial cells, endothelial cells in vitro co-culture simulate, pointing at the important pathological aspects during the early damage of cerebral ischemia and cerebral hemorrhage – the activation of ROS-HIF1-BNIP3/NIX-Autophagy molecular signal pathway and regulation of autophagy on ROS, uses laser confocal immune double staining method, MRI, electron microscopy, molecular biology and enzyme immunoassay methods from both in vivo and in vitro aspects comprehensively to explore the mechanism of XNJ protect the neurovascular unit by regulating the interplay between ROS and autophay. This study will provide a theoretical basis for Chinese medicine interventing the early stage of acute ischemic and hemorrhagic stroke under the theoretical guidance of " abnormal collateral - toxin damage brain collaterals ".

活性氧和自噬在维持细胞存活及稳态方面有重要作用，出血性及缺血性脑卒中早期均存在不同程度的激活，如何适度调控活性氧与自噬及交互作用是目前脑卒中研究的重点之一。临床实践证明醒脑静在急性期未能进行影像学评价，不能明确诊断出血和缺血性质时，具有早期干预优势。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型和自体血注入脑出血两种动物模型，同时结合神经细胞、胶质细胞、内皮细胞共培养体外模拟神经血管单元模型，针对脑卒中损伤早期激活的活性氧诱导自噬的ROS-HIF1-BNIP3/NIX分子信号通路及自噬对活性氧的反馈作用，采用激光共聚焦免疫双标、影像学评价、电镜、分子生物学等方法，综合分析醒脑静通过调控活性氧和自噬的适度活化及交互作用维持细胞内稳态保护神经血管单元的途径和机制，为在“病络—毒损脑络”理论指导下，中医药早期干预出血和缺血性中风病提供理论基础和实验依据。

临床实践证明醒脑静在急性期未能进行影像学评价，不能明确诊断出血和缺血性质时，具有早期干预优势。本课题主要采用脑缺血和脑出血两种模型，结合网络药理学和TMT蛋白质组学预测发现醒脑静的作用靶点，利用MRI影像学分析脑梗死半暗带和出血体积转化，采用电镜、分子生物学、免疫染色等方法，综合分析醒脑静保护神经血管单元的途径和机制。结果表明：（1）大鼠MCAO模型造模后4.5小时、24小时、7天连续MRI检测，将DWI、PWI联合应用判定各组缺血半暗带的变化，通过ADC以及CBF等值计算半暗带丢失率和脑梗死体积、血流；采用T2加权分析脑出血3天后出血体积大小。结果显示早期应用醒脑静具有挽救缺血半暗带、减轻梗死和促进血肿吸收、降低脑水肿的作用优势。（2）病理、透射电镜观察并分析神经血管单元结构，结果表明醒脑静可有效改善脑出血和脑缺血急性期神经元形态、星形胶质细胞足突水肿、血管内皮和血脑屏障紧密连接。（3）蛋白质组学方法分析缺血脑组织24小时和7天差异蛋白，并对潜在的靶点蛋白进行生物信息学注释分析，结果显示氧化磷酸化、代谢通路、HIF-1信号通路、谷胱甘肽代谢、补体及凝血级联等为醒脑静干预脑缺血的显著富集通路和特征。（4）通过大鼠脑缺血模型结合神经细胞和脑微血管内皮细胞体外缺氧模型，结果表明醒脑静能显著提高神经元和内皮细胞的活性，减轻caspase-3表达降低细胞凋亡,调节自噬蛋白Beclin-1,减少COX-2、ROS的产生，促进GPX4、ZO-1、claudin-5的表达。（5）采用网络药理学预测醒脑静注射液的有效成分、关键作用靶标，GO和KEGG通路富集分析显示其作用网络与调节白细胞炎症反应， MAPK、P13K-Akt、mTOR、Hif-1等信号通路有关，与凋亡、细胞粘附、调控自噬等相关；进一步结合模块药理学分析获得醒脑静干预脑出血的靶点。（6）醒脑静通过调控脑出血模型HIF-1信号通路，降低HIF、BNIP3、Beclin-1、LC3、iNOS表达，促进AnxA1、Bcl-2,减少Bax，调节自噬、凋亡、炎症和氧化应激反应；降低VEGF、MMP-9、AQP4,提高ZO-1、Claudin-5，改善血脑屏障细胞结构和紧密连接, 减轻脑出血继发损伤。