OPG诱导破骨细胞凋亡的分子机理

Applicant and co-workers have demonstrated that osteoprotegerin (OPG) not only inhibited the differentiation and maturation of osteoclast, but also promoted the development of apoptosis of mature osteoclast in vitro, however, the mechanism remains unclear. This study bases on the established methods of osteoclast formation and purification in vitro. Different concentrations of OPG (0、10、20、30、50、100ng/ml) will be added into the cell culture at destined time points. In regard to osteoclast, the differentiation and growth will be observed by xCelligence System, the percentage of apoptosis and cell cycle will be assayed by flow cytometry, and the apoptotic features will be surveyed with inverted microscope and electron microscope which are reflected via morphological change. The expressions of promoting apoptosis genes (p53、c-myc、Bcl-2 family、Smac and the other like) and restraining apoptosis genes (IAP and Bcl-2 family and so on and so forth) will be determined by western blot and quantitative real-time PCR methods. Death receptor pathway (Fas、FasL expression), mitochondrial pathway (mitochondrion framework; MPTP, VDAC, and ANT expression; cyt-c release; caspase activation), and endoplasmic reticulum pathway (concentration of Ca2+, Calpain and CaMKⅡ expression) which are triggered by the aforementioned regulatory genes will be further studied. The aim of this study is to ascertain the apoptosis of osteoclast develop in which cell cycle and determine the characteristics of apoptotic osteoclast, which are induced by OPG. The critical regulatory genes and signaling pathways which dominate the OPG-induced osteoclastic apoptosis will be further identify.

OPG不仅抑制破骨细胞的分化和成熟，申请者还发现可诱导体外成熟破骨细胞的凋亡，其凋亡调控机理仍不清楚。本项目是在建立体外破骨细胞生成和纯化培养的基础上，用不同剂量的OPG（0、10、20、30、50、100ng/ml）处理，实时细胞分析系统观察细胞分化与生长特性，流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期，形态学观察凋亡的特征，Western blot、荧光定量PCR检测促凋亡基因（p53、c-myc、Bcl-2家族、Smac等）和抗凋亡基因（IAP和Bcl-2蛋白家族等）的表达，进一步研究调控基因激发的死亡受体途径（Fas、FasL表达）、线粒体途径（线粒体结构，MPTP、VDAC、ANT表达及cyt-c释放和caspase激活状态）和内质网途径（细胞Ca2+浓度、Calpain及CaMKⅡ表达），确定OPG 诱导破骨细胞凋亡发生的细胞周期及特性，阐明其主要的调控基因和信号转导途径。

骨保护素（OPG）能通过阻断核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和RANK结合来完成诱骗受体功能，从而抑制破骨细胞（OCs）的分化和活性。本研究旨在阐明OPG诱导OCs凋亡的分子机制。重要的结果及意义如下：.（1）OPG处理显著增强分化初期细胞（1 d）的存活、增殖及黏附能力，并促进RANK和integrin β3表达量显著增高。相反，OPG抑制成熟的破骨细胞（3-7 d）的分化及黏附结构的形成，并显著降低了TRAP、RANK、integrin β3、MMP9、cathepsin K、CA II及V- ATPase A1标志性蛋白的表达水平。说明OPG对于破骨细胞分化不同阶段的生物效应是有差异的。（2）OPG处理组OPCs的凋亡率显著增加，OPG处理组OCs的凋亡率显著增加，呈剂量-效应关系。表明OPG诱导破骨细胞及其前体细胞凋亡。（3）OPG处理使得OCs中促凋亡基因Bax的转录水平显著升高，RhoV mRNA的表达量也显著上调，抑凋亡基因Bcl-2基因的转录水平极显著降低，呈剂量-效应关系。随着OPG浓度的增加，Bax的表达量上升、Bcl-2的表达量下降，Bax/Bcl-2极显著增加。表明OPG能通过促进促凋亡基因表达和抑制抑凋亡基因表达来诱导破骨细胞凋亡。（4）OPG抑制了破骨细胞生成和黏附结构的形成，显著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平。说明OPG通过Ca2+和ERK信号通路破坏破骨细胞黏附结构，激活Src使其作为衔接蛋白补充减少的磷酸化Pyk2，而p38 MAPK信号通路可能在这过程中发挥着不同的作用。（5） 20和40 ng/mL OPG能显著增加Fas的转录及表达水平和caspase-8的活化程度，但80 ng/mL OPG处理会显著地降低Fas的转录及表达水平。OPG处理显著增加 FasL的转录及表达水平，但上清中的sFasL含量显著减少。Co-IP法检测发现OPG能与sFasL结合。这一结合会阻滞sFasL对OCs和OPCs凋亡的抑制作用。表明OPG诱导OCs和OPCs凋亡的Fas/FasL死亡受体途径。（6）OPG处理能诱导OCs和OPCs中cyt. c从线粒体释放到胞浆，激活caspase-9和caspase-3，AIF和Endo G发生核转位。表明OPG能通过线粒体凋亡途径诱导OCs和OPCs发生凋亡。