OPG抑制破骨细胞分化成熟的信号转导机制

通过OPG/RANK/RANKL调控途径诱导大鼠破骨细胞的形成和活化，用倒置显微镜观察细胞形态、检测破骨细胞TRAP和MMP-9表达、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝等鉴定破骨细胞活性。在培养液中加入不同浓度的OPG（10.0、20.0、30.0、50.0ng/ml）处理，在培养过程的不同时间通过免疫组化法、免疫印迹法和激光共聚焦显微镜等检测破骨细胞NF－κB、MAPK（ERK－MAPK途径、JNK/SAPK－MAPK途径和p38－MAPK途径）及Ca2＋信号转导通路激活过程中关键信号分子的表达；在此基础上，分别用信号转导抑制剂（NF－κB特异性抑制剂、ERK抑制剂、JNK抑制剂、p38－MAPK抑制剂、Ca2＋信号转导抑制剂）处理细胞后检测这些关键信号分子的表达，确定这些信号转导通路是否调控OPG抑制大鼠破骨细胞的分化成熟，并揭示其调控过程的可能机制。

通过OPG/RANK/RANKL调控途径诱导大鼠破骨细胞的形成和活化，用倒置显微镜观察细胞形态、检测破骨细胞TRAP和MMP-9表达、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝等鉴定破骨细胞活性。在培养液中加入不同浓度的OPG（10.0、20.0、30.0、50.0、100ng/ml）处理，在培养过程的不同时间检测破骨细胞NF－κB、MAPK（ERK－MAPK途径、JNK/SAPK－MAPK途径和p38－MAPK途径）信号转导通路激活过程中关键信号分子的表达；在此基础上，分别用信号转导抑制剂（NF－κB特异性抑制剂、ERK抑制剂、JNK抑制剂、p38－MAPK抑制剂）处理细胞后检测这些关键信号分子的表达。结果表明，（1）体外培养鸭胚破骨细胞1-7天，30ng/mL、100ng/mL OPG组TRAP阳性细胞数均显著或极显著少于对照组（P<0.05或P<0.01）；第11天 30ng/mL OPG组TRAP阳性细胞数与对照组差异不显著（P>0.05），而第18天 30ng/mL OPG组TRAP阳性细胞数显著多于对照组（P<0.05或P<0.01）；OPG能够剂量依赖性抑制鸭胚OC的骨吸收活性。（2）OPG可使RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞过程中NF-κB65表达量降低，而使细胞IκBα、IκBα表达量增加；100µM PDTC阻断NF－κB通路后，上述指标的变化与OPG浓度之间无显著关系，表明OPG抑制破骨细胞形成过程中NF－κB信号通路发挥了调控作用。（3）在M-CSF + RANKL诱导作用下，15分钟内RAW264.7细胞中MAPK家族中的 p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三条信号转导通路均被激活。而OPG能够下调p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三种信号蛋白磷酸化水平，随OPG浓度升高及OPG作用时间延长，该抑制作用愈加明显。加入特异性MAPK信号转导通路抑制剂后检测上述各信号蛋白表达，进一步证实了MAPK信号途径参与破骨细胞分化过程。