一个新的蛋白酶系统RhpPC调控III型分泌系统的信号传导途径研究

Pseudomonas syringae, one of the leading causes of crop diseases world-wide, uses type III secretion system (T3SS) to invade host plants. The type III secretion system (T3SS) of plant pathogenic bacteria is induced in the plant and minimal media (MM). Although a number of components regulating the T3SS gene expression have been identified, how bacteria sense the environmental conditions and further transfer the signal(s) to the known regulatory components remain largely unknown. We use the model plant pathogen Pseudomonas syringae to study the signaling transduction pathway regulating T3SS genes. We have identified a novel protease (RhpP) and its putative chaperone (RhpC) regulating T3SS genes in plant. Preliminary results indicated that the protease RhpP, directly degrade HrpL to repress the T3SS genes. The chaperone RhpC is necessary for extracellular secretion of RhpP under the T3SS-inducing conditions, thus derepressing the T3SS genes. This proposal is aimed at understanding the signaling process governing the RhpPC-mediated regulation of T3SS genes. Genetic and biochemical characterization of the functions of the RhpPC protease system is the first step toward identifying signals to which the system responds, and toward the development of new strategies for disease control based on manipulation of the system.

丁香假单胞菌属（Pseudomonas syringae）是全世界农作物的主要病原菌之一，其致病性主要由III型分泌系统（T3SS)介导。虽然目前已经鉴定了一些调节T3SS信号转导的组份，但是细菌如何感应环境信号并作出相应的反应还知之甚少。我们在丁香假单胞菌中发现一个新的蛋白酶和类分子伴侣蛋白，分别命名为RhpP和RhpC。根据初步实验结果推测，蛋白酶RhpP通过直接切割HrpL从而抑制T3SS表达，而分子伴侣蛋白RhpC通过协助RhpP向细胞外分泌从而解除对T3SS基因表达的抑制作用。本课题旨在进一步通过生化和遗传学手段，研究假单胞菌中RhpP和RhpC系统分子作用机制和对细菌致病力的影响；通过转录组和蛋白组分析，探索RhpPC上下游调控关联基因并解析T3SS信号转导途径。T3SS作为细菌重要的致病因子分泌系统，对其调控表达机制的研究可以为植物病原菌的防控提供新策略。

假单胞菌在内的许多植物病原菌利用III型分泌系统（T3SS）将效应蛋白传递到植物细胞中。编码T3SS及其效应子的基因在富营养培养基中受到抑制，但在细菌进入植物或转移到缺营养的培养基后则被迅速诱导。为了了解T3SS基因是如何被调控的，我们筛选了P. savastanoi pv. phaseolicola （Psph）突变体中T3SS基因报告基因avrPto-luc的诱导减弱。在植物和基本培养基（MM）中发现了一个携带转座子插入到一个小功能未知蛋白（命名为rhpC）基因中的突变体，在该突变体中avrPto-luc活性不能被诱导。有趣的是，rhpC位于金属蛋白酶基因rhpP的下游，两个基因在一个操纵子rhpPC；而rhpP和rhpC在营养丰富的King 's B培养基（KB）和MM中表现出不同的RNA表达模式。整个rhpPC位点的缺失对avrPto-luc的诱导没有显著影响，表明rhpP和rhpC在调控T3SS基因方面有协调作用。进一步分析表明，RhpC是一种与RhpP相互作用并靶向协助RhpP分泌至周质的细胞质蛋白。在没有RhpC的情况下，RhpP定位于细胞质中，导致T3SS基因的关键调控因子HrpL的减少，也降低了Psph的适应性。在大肠杆菌中单独表达RhpP能抑制细菌的生长。金属蛋白酶活性位点对于RhpP对Psph和大肠杆菌的适应性的损害至关重要，但是当RhpC与RhpP共表达时，其损害作用会被抑制。rhpP和rhpC协调调控T3SS基因表达和细胞适应性，揭示了一种新的细菌发病机制。另外，蛋白组学得到了5个RhpP潜在的T3SS效应蛋白底物，包括HrpK1、AvrE1、HopG1、HopAJ1和HopAU1。我们通过最新研发的HT-SELEX技术确定rhpPC的上游直接调控蛋白PSPPH_3618。PSPPH_3618可以直接结合rhpP的启动子区域，并对rhpPC的表达进行调控。转录组学也研究发现RhpC是一个重要的T3SS正调因子，并且发现rhpP能够响应环境渗透压的变化，这可能与渗透压相关的OmpR-EnvZ有关。envZ突变体中rhpPC的表达量也显著降低。总之，我们解析了T3SS相关的蛋白酶系统RhpPC的分子调控机制，为未来后续的药物筛选和研发提供重要的理论基础。