一个新的双组分系统RhpRS调控III型分泌系统的信号转导途径研究

The type III secretion system (TTSS) of plant pathogenic bacteria is expressed induced in the plant apoplast and induced in the minimal media (MM). Although several signaling components regulating the TTSS gene expression have been identified, how bacteria sense the environmental conditions and further transfer the signal(s) to the known regulatory components remain largely unknown. We use P. syringae as an experimental system to study the signaling transduction pathway regulating TTSS genes. We have identified a novel two-component system (TCS) RhpRS regulating TTSS genes in plant and MM. Preliminary results indicated that the response regulator RhpR, upon phosphorylation, represses the TTSS genes. The sensor RhpS appears to act as an intrinsic phosphatase preventing formation of phospho-RhpR (P-RhpR) under the TTSS-inducing conditions, thus derepressing the TTSS genes. This proposal is aimed at understanding the signaling process governing the RhpRS-mediated regulation of TTSS genes. Genetic and biochemical characterization of the functions of the RhpRS regulatory system is the first step toward identifying signals to which the system responds, and toward the development of new strategies for disease control based on manipulation of the system.

植物病原细菌III型分泌系统(TTSS)编码基因在植物质外体和基本培养基中诱导表达。尽管目前已经鉴定了一些调节TTSS信号转导的组份，但是细菌如何感应环境信号并作出相应的反应还知之甚少。我们在丁香假单胞菌中发现一个新的双组份系统，命名为RhpRS，根据初步实验结果推测，反应调节蛋白RhpR通过磷酸化抑制TTSS表达，传感器激酶RhpS在TTSS诱导表达条件下作为磷酸酶抑制RhpR的磷酸化(P-RhpR)，解除对TTSS基因表达的抑制作用。本课题旨在进一步通过生化和遗传学手段，研究假单胞菌中RhpRS双组份系统对TTSS的功能的影响；并通过基因芯片分析，发掘RhpRS上下游调控关联基因并解析TTSS信号转导途径。TTSS作为细菌重要的致病因子分泌系统，对其调控表达机制的研究可以为植物病原菌的防控提供新策略。

植物病原细菌III型分泌系统(TTSS)编码基因在植物质外体和基本培养基中诱导表达，尽管目前已经鉴定了一些调节TTSS信号转导的组份，但是细菌如何感应环境信号并作出相应的反应还知之甚少。我们在丁香假单胞菌中发现了一个新的双组份系统，命名为RhpRS，，反应调节蛋白RhpR通过磷酸化抑制TTSS表达，传感器激酶RhpS在TTSS诱导表达条件下作为磷酸酶抑制RhpR的磷酸化(P-RhpR)，解除对TTSS基因表达的抑制作用。通过生化和遗传学手段，研究了假单胞菌中RhpRS双组份系统对TTSS的功能的影响，发现RhpR通过调节hrpRS操纵子进而对TTSS进行调控。在植物体内，PSPPH2198突变体中的avrPto-luc活性显著降低。而PSPPH2198-2199突变体能够部分恢复PSPPH2198突变体的表型， PSPPH2198是作为一个分子伴侣抑制PSPPH2199活性。TTSS作为细菌重要的致病因子分泌系统，对其调控表达机制的研究可以为植物病原菌的防控提供新策略。. 为检验水稻miRNA与靶标基因之间的调控关系，将MIRNA 基因与GFP /靶标序列融合基因 (或GFP /靶标突变序列融合基因) 构建在同一瞬时表达载体上，并转化水稻原生质体，通过观察含有GFP /靶标序列融合基因和GFP /靶标突变序列融合基因的载体之间的荧光强度差异，以及通过qRT-PCR 方法检测靶标和非靶标mRNA 水平差异来验证miRNA 对靶标基因的调控。用osaMIR156 和osaMIR397 及其靶标序列对实验设计方法进行验证，荧光显微观察和qRT-PCR 检测证明，osamiR156 和osamiR397 能降低相应靶标序列GFP 融合基因的转录物水平和GFP荧光水平。此种水稻原生质体瞬时表达方法用于在体内进行大规模miRNA 靶标基因检测。由于其他近缘单子叶植物很可能与水稻有近似的小RNA 加工系统，因此对于其他单子叶植物miRNA 功能研究也将有很好的应用前景。