TetR家族调控因子AtrA调节达托霉素生物合成的转录调控机制研究

By affinity purification with dptEp, the promoter of daptomycin synthesis gene cluster in Streptomyces roseosporus, we have identified AtrA, a TetR-family transcriptional regulator, to directly interact with dptEp. Here we will further explore the molecular transcriptional regulatory mechanism of AtrA on the biosynthesis of daptomycin by regulating dptEp activity and on the transport of daptomycin by regulating dptM/N expression. We will also study the feedback regulatory mechanism of daptomycin on AtrA regulation, and the auto-regulation mechanism of AtrA on its own gene expression during the biosynthesis of daptomycin. Thus we will first reveal the transcriptional regulatory mechanisms for daptomycin biosynthesis, which is coordinated with fine-tuned auto-regulated atrA expression, and we will also elucidate the molecular mechanism of low daptomycin production resulting from the low expression of gene cluster and establish a theoretical basis of strain engineering for hyper-production of daptomycin.

本课题以自行筛选到的达托霉素工业生产菌种玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)SW0702为对象,利用达托霉素(daptomycin)生物合成基因簇启动子dptEp亲和分离纯化到能与启动子DNA片段直接相互作用的TetR家族转录调控因子AtrA。本课题将深入研究AtrA调节dptEp表达活性调控达托霉素生物合成的分子机制，调节转运蛋白基因dptM/N表达调控达托霉素转运效率的分子机制，以及达托霉素产量对AtrA调控作用的反馈调节机制，同时研究在达托霉素生物合成过程中，AtrA因子对自身基因atrA表达的调控机制。本课题将首次揭示达托霉素生产的转录调控机制、达托霉素的反馈调控机制以及atrA基因表达与达托霉素生产的协同效应机制，阐明工业生产菌中合成基因簇表达水平低导致达托霉素不能高产的分子机制，并为高产菌株构建奠定理论基础。

达托霉素是玫瑰孢链霉菌生产的新型脂肽类抗生素，具有非常好的抗革兰氏阳性致病细菌活性。达托霉素的生物合成基因簇已经被克隆，但是其生物合成的调控机制还未深入研究，并限制了其优质高产遗传改造。我们以达托霉素合成基因簇的启动子dptEp为靶点，利用体外亲和纯化技术分离鉴定到三个能够与dptEp直接相互作用的转录调控因子AtrA、DepR1与DepR2。. 我们发现AtrA是达托霉素生物合成的正调控因子。AtrA对dptEp转录活性有正调控作用，同时对自身基因表达也有正反馈调控作用。玫瑰孢链霉菌含保守的A-因子信号途径，其下游多效调控因子AdpA能够直接结合在atrA基因启动子上，正调控atrA基因表达，进而调控达托霉素合成。因此我们敲除上游A-因子受体蛋白基因arpA，构建了达托霉素产量提高2.5倍的菌株。. 磷酸双组份信号系统（PhoRP）中PhoP也能够结合在atrA基因启动子上，并正调控atrA基因表达以及下游达托霉素生物合成。同时PhoP与AdpA部分竞争性地结合在atrA启动子。同时磷酸双组份系统能够在转录水平上抑制adpA基因的表达，表明两条信号途径能在蛋白水平、转录水平上进行竞争调控。. TetR-家族调控因子DepR1正调控dptEp的表达从而调控达托霉素的生物合成，而且DepR1也能够结合到自身启动子上正调控自身基因表达；因此高表达depR1基因使达托霉素的产量提高40%。而MarR-家族调控因子DepR2是达托霉素生物合成的负调控因子，敲除depR2后，达托霉素的产量也提高了2.5倍。. 我们的工作首次系统解析了达托霉素生物合成的转录调控机制，多条信号途径协同调控与竞争调控的复杂调控网络，特别是揭示了保守的激素响应、营养响应信号途径间独特的竞争模式与交叉调控机制，进一步扩充了链霉菌次级代谢调控网络，具有重要的理论意义。同时我们在解析调控机制的基础，实现了达托霉素的高产遗传改造，为进一步工业化应用奠定了基础，具有较好的产业意义。. 本课题在JBC，AEM等主流期刊发表SCI论文6篇，获授权发明专利1项。