MarR-家族调控因子PdrR1降解的分子机制及其对达托霉素生物合成的转录调控机制研究

In the daptomycin industrial producer Streptomyces roseosporus SW0702, we have used proteasome to isolate one of its degradation substrates, a MarR-family transcriptional regulator PdrR1, which could directly bind to the promoter of daptomycin gene cluster. In this project, systemic experiments will be demonstrated to investigate the degradation mechanism of PdrR by the proteasome, and we will also reveal the regulatory mechanism of PdrR1 on the expression of daptomycin gene cluster, proteasomal genes, its own gene pdrR1, and all these regulatory effects on daptomycin production. Furthermore, the feedback effects of daptomycin on PdrR1 transcriptional regulation will also be enthusiastically examined. Thus for the first time we will reveal the regulatory mechanism of proteasome on secondary metabolism by controlling the protein stability of transcriptional regulators, the pleiotropic transcriptional regulatory mechanisms mediated by PdrR1 on daptomycin biosynthesis, and the feedback regulation by secondary metabolites. Thus we will establish the multi-layer molecular regulatory network for daptomycin biosynthesis, and provide the theoretical basis for rational designing and recombinatory genetic engineering of regulatory pathways.

我们在工业生产菌玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)SW0702的蛋白酶体缺失株中筛选到降解底物MarR-家族转录调控因子PdrR1，该因子能直接结合达托霉素合成基因簇启动子。本课题将深入研究蛋白酶体降解PdrR1的机制，转录因子PdrR1调控蛋白酶体基因表达、调控自身基因表达、调控达托霉素合成基因簇表达等分子机制，以及达托霉素对PdrR1转录调控作用的反馈调节机制，揭示链霉菌蛋白酶体通过调控转录因子蛋白稳定性进而调节次级代谢过程的分子机制，解析转录因子PdrR1调控达托霉素生物合成的多重正反馈转录调控机制以及次级代谢产物的反馈调控机制，从分子水平解析并建立多层次达托霉素生物合成的调控网络，为工业链霉菌调控途径理性重组进行高产遗传改造提供理论依据。

链霉菌是临床上抗生素的重要生产菌，但是其生化、遗传操作体系匮乏，同时缺乏抗生素等活性天然产物合成的调控元件，对其生物合成的调控机制了解不深入，特别对蛋白质翻译后修饰如何调控链霉菌代谢发育等机制了解甚少，严重阻碍了链霉菌作为重要抗生素生产菌的开发。. 我们建立了基于组学水平（转录组、蛋白质组）的调控因子挖掘技术，获得了多个次级代谢特异性强启动子，并显著提升了抗生素的合成水平；我们在链霉菌中建立了一套亲和表达标签体系，实现了链霉菌中蛋白的重组表达和亲和纯化；我们通过多重控制Cas9活性，进一步优化了链霉菌中CRISPR-Cas9遗传操作系统，通过对DNA转化和Cas9切割解偶联，实现了链霉菌高效基因组编辑。. 我们在达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌中，解析了达托霉素生物合成调控因子PhaR（原名字PdrR1）在转录水平上直接调控达托霉素基因簇启动子dptEp、自身启动子phaRp的分子机制，发现该因子是抗生素合成的负调控因子，并通过遗传工程构建了高产菌株。. 链霉菌中酰基-CoA既是天然产物合成的前体，也是蛋白质修饰的酰基供体，因此可能对链霉菌代谢发育有重要调控作用。我们发现玫瑰孢链霉菌中有丰富的巴豆酰化修饰（crotonylation），且对细胞生长、抗生素合成、糖利用与代谢等具有重要调控功能。我们解析了巴豆酰化系统通过修饰酶CobB、Kct1调控葡糖糖激酶Glk修饰，进而调控链霉菌代谢发育的分子机制。. 我们的工作优化了链霉菌遗传、生化体系，为进一步深入开展链霉菌次级代谢调控机制研究提供了有力的工具；解析了调控因子PhaR对达托霉素生物合成的转录调控机制，并构建了高产菌株，解析了蛋白质翻译后修饰对链霉菌代谢的调控机制，为从分子水平解析（转录、翻译后修饰）并建立多层次达托霉素生物合成的调控网络，为工业链霉菌调控途径理性重组进行高产遗传改造提供理论依据。