猪肺炎支原体感染相关毒力因子的挖掘

Mycoplasma hyopneumoniae is the important pathogen threatening the global pig industry, with persistent infection, long-term contaminated and difficult to clean features. Currently, little is known about the virulence factors of M. hyopneumoniae, which hindered the new vaccine development of M. hyopneumoniae. M. hyopneumoniae strain 168, with clear genetic background, is highly virulence strain of our own separation in our country, and the 168 pro-passage attenuated strains is widely used as vaccine stains in China, and it is good materials for research of M. hyopneumoniae virulence associated factors. This project intends to analysis the protein component of the group of three generations on behalf of different virulence 168 strains and establish difference in protein expression profiles, with the fluorescence difference gel electrophoresis and multidimensional liquid chromatography technology. Then screen M. hyopneumoniae virulence-associated candidate proteins combined with bioinformatics prediction and the 2D-GE fluorescent hybirdization. The project will evaluate the correlation of candidate proteins and virulence through the adhesion, damage degree and Ca2+ releasing level of swine ciliated epithelial cell and the IL-1β and TNF-αsecretion levels and phagocytic capicity of porcine alveolar macrophage cells, confiming new infectious virulece-associated factors. This research will reveal the foundation of the pathogenic mechaism of M. hyopneumoniae.

猪肺炎支原体（Mycoplamsa hyopneumoniae, Mhp）是危害全球养猪业的重要病原，具有持续感染、长期带菌和难以净化的特征。目前，关于Mhp的毒力因子还知之甚少，阻碍了Mhp新型疫苗的研究。Mhp 168株是我国自行分离的强毒株，遗传背景清楚，而且以168株为亲本的传代致弱株已作为疫苗株在我国广泛使用，是研究Mhp毒力相关因子的良好材料。本项目拟采用荧光差异凝胶电泳技术与多维液相色谱技术，对体内感染的Mhp168强弱毒株进行蛋白组学分析，建立差异蛋白表达谱；结合生物信息学预测和2D-GE荧光杂交技术筛选出Mhp毒力相关候选蛋白，并从各候选蛋白对体外气液培养模型中猪纤毛上皮细胞的黏附、损伤程度、Ca2+变化情况、以及对猪肺泡巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌情况及吞噬能力等三方面评价各候选蛋白与毒力的相关性，确定新的Mhp感染相关毒力因子，为揭示Mhp的致病机制奠定基础。

猪肺炎支原体（Mycoplamsa hyopneumoniae, Mhp）是引起猪气喘病的重要病原，具有持续感染、长期带菌和难以净化的特征。毒力相关因子在支原体的感染与致病中扮演着十分重要的角色，但目前对猪肺炎支原体的毒力相关因子还知之甚少，仅证实部分黏附蛋白与毒力相关，尚难以解释其复杂的致病机制。. Mhp 168株是我国自行分离的强毒株，与其传代致弱株168L的遗传背景十分接近，其毒力差异落脚在蛋白水平，是利用比较蛋白组研究Mhp毒力相关因子的良好材料。本项目采用二维凝胶电泳技术对强毒株和弱毒株的全菌蛋白进行比较分析，发现在KM2培养基培养的条件下，相比弱毒菌株168L，7个蛋白在168强毒株中表达量上调，分别为Molecular chaperone DnaK (DnaK or Hsp70 or P42)，Elongation factor Tu (EF-Tu)，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)，Adenine phosphoribosyltransferase (Apt)，L-lactate dehydrogenase (LDH or P36)，Heat shock protein (GrpE)和Fructose-bisphosphate aldolase (FBA)。这7个差异蛋白全部位于由已知毒力因子构成的互作网络中，且都属于功能比较保守的生长代谢过程中的酶。绝大部分差异蛋白的编码基因属于核心基因。表达量变化最显著的蛋白FBA位于猪肺炎支原体表面，是一个新型的黏附因子。. 利用体外猪气管上皮细胞模型，发现菌株感染细胞后6个蛋白表达量上调，分别为YX2，Pyruvate dehydrogenase，EF-Tu，Enolase，Apt和GAPDH。其中EF-Tu和Enolase位于毒力互作网络中的关键节点位置，且都位于支原体表面。EF-Tu还通过结合纤连蛋白发挥重要的黏附作用。. 综上，本研究筛选出大量猪肺炎支原体毒力相关致病因子，对阐明病原的致病机理，正确认识疾病的发生和发展，研究亚单位疫苗有效防控该病具有重要的意义。