硬脂酰辅酶A脱氢酶1在鹅肥肝形成过程中的功能研究

鹅肥肝富含对人体有益的不饱和脂肪酸，是对人类健康有益的高档食品。本研究选择与鹅肥肝形成密切相关的硬脂酰辅酶A脱氢酶1基因，通过对该基因的全长基因组序列和cDNA序列进行分离克隆，分析该基因结构；利用PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法研究该基因多态位点在不同鹅群的遗传变异及其与朗德鹅产肝性能的关系，并检测该基因编码蛋白在肥肝形成过程中的表达规律；以鹅原代成熟肝脏细胞为材料，采用过量表达和RNA干扰SCD1基因等方法，分析加强和干扰SCD1基因的表达前后肝脏细胞内脂肪代谢的变化及细胞凋亡情况，采用Real-time 定量RT-PCR技术研究细胞内脂类代谢相关基因的表达水平，阐明该基因在鹅肥肝形成过程中的生物学功能，为鹅肥肝性状的分子标记辅助选择和营养调控提供理论依据，同时也为人类脂肪肝的研究提供重要参考。

本研究以朗德鹅为素材，采用RT-PCR和RACE技术获得了朗德鹅SCD1基因的完整cDNA序列，包含1083 bp的CDS序列，78 bp的5’UTR，2.1 kb的3’UTR，包含6个外显子，编码360个氨基酸；预测其蛋白质分子量为40967.2 Da，等电点为8.8，为亲水性蛋白，存在四个跨膜区域。通过PCR-SSCP技术检测到SCD1基因外显子和非编码区上共6个SNPs，在朗德鹅外显子2的132 bp处存在T/C碱基替换，产生了3种基因型，各基因型间产肝性能差异不显著。3’UTR区域检测到5个SNPs，共形成5种基因型组合，其中H1H1的肝体比和肝重均大于其它4种单倍型组合，可以作为基因标记进行高产肝个体的选择。利用高能玉米对70日龄朗德鹅进行填饲，western blotting技术检测朗德鹅肝脏中SCD1基因编码蛋白水平发现，填饲后SCD1基因编码的蛋白水平增加。利用“胶原酶消化法”从朗德鹅胚中分离出高活性、高纯度的原代成熟肝脏细胞，建立鹅胚原代肝细胞培养体系。一定剂量果糖、胰岛素单独添加以及协同作用均能增加鹅原代培养肝细胞SCD1基因表达水平。通过构建SCD1基因真核表达载体转染鹅胚原代肝细胞，荧光定量PCR检测SCD1基因mRNA水平显著升高，同时细胞中脂类代谢相关基因SREBP-1基因表达水平也显著升高。根据SCD1的mRNA序列设计合成3对小双链干扰RNA（siRNA）以及阴性对照，转染鹅原代肝细胞，RNA干扰SCD1基因表达后，与脂肪合成相关的基因FAS、ACC表达下调，肝细胞外液的脂类代谢产物减少，反映了肝细胞脂类合成减少。研究结果表明SCD1基因能促进肝脏脂肪合成，在鹅肥肝形成过程中起重要作用。