鹅肥肝形成过程中miRNA表达及其调控网络研究

Fatty liver disease is a metabolic disease which affects human health seriously. However the molecular mechanisms of pathogenesis are still unclear. Goose has a natural ability to store lipid in its liver, without any obvious pathological symptoms when recovered, which provides an ideal model for studying on fatty liver. In this project, Landes will be overfed with a carbohydrate-rich diet to induce the fatty liver. Next-generation sequencing technologies will be used to detect the expression of miRNAs through fatty liver formation. Combine with previous studies of goose fatty liver transcriptomics and some bioinformatics methods, the miRNAs and their target genes and the metabolic pathways which have important relationships with goose fatty liver will be identified. And on this basis, miRNAs over-expression and interference in goose liver cells will be used to understand their effect to the target genes and fat metabolism. In this project, based on the transcriptomics research, goose will be chosen as the animal model to study the miRNAs expression during the formation of fatty liver and the network between miRNAs and genes. This can provide useful evidence to help expanding knowledge in human fatty liver research.

脂肪肝是严重影响人类健康的代谢疾病，其致病的分子机制还不是十分清楚。鹅肝脏沉积脂肪能力很强，它不仅在形成脂肪肝（肥肝）后可以恢复，而且没有明显的病理症状，是人类脂肪肝研究理想的动物模型。本项目以朗德鹅为素材，人工填饲高能饲料，诱发其产生脂肪肝，采用第二代高通量测序方法，检测鹅肥肝形成过程中miRNA的表达情况，结合本课题组前期鹅肥肝转录组学等研究结果及生物信息学方法预测和筛选出与鹅肥肝形成有重要关联的miRNA及其靶基因和代谢途径，在此基础上，在鹅细胞水平上，采用miRNA过表达或干扰方法，了解目标基因表达及对脂类代谢的影响。本研究旨在以鹅为动物模型，以转录组学研究为基础，了解鹅肥肝形成过程中miRNA的表达及其与基因间的网络调控，为人类脂肪肝研究提供有益的参考。

microRNA（miRNA）是一类长约21-23nt的非编码RNA分子，其对基因的后转录调控发挥重要作用。已有研究表明miRNA在人和小鼠肝脏脂肪代谢障碍中起着重要调控作用。鹅肝脏沉积脂肪能力很强但不会有明显的病理症状，是研究肝脏脂类代谢很好的模型。本研究采用第二代高通量测序方法，检测鹅肥肝形成中差异表达的miRNA，利用生物信息学方法预测miRNA的靶基因，同时结合前期转录组测序研究结果，构建miRNA与基因间调控网络，筛选出可能起核心作用的miRNA和靶基因。然后从筛选结果中挑选部分重要miRNA和对应靶基因（miRNA-33和CROT基因），利用鹅原代肝细胞分离培养技术、荧光定量PCR技术、Western Blot等技术进行靶向关系验证及调控机制研究，为进一步阐明鹅肥肝形成的分子机制奠定基础。通过对鹅不同填饲阶段（7天、14天和19天）填饲组和对照组的肝脏进行小RNA测序，并对原始数据进行过滤、拼接和注释，最终获得了1163个有注释信息的miRNA。在三个时间点分别筛选出30（17个填饲组上调）、48（36个填饲组上调）和151（114 个填饲组上调）个差异表达的miRNA。对获得的预测靶基因进行KEGG pathway富集分析发现，起关键调控作用的显著富集通路包括：碳水化合物、脂质和氨基酸代谢通路，细胞生长死亡通路，免疫系统通路等。以差异表达miRNA的靶基因预测结果为基础，使用STRING数据库预测靶基因的互作关系并构建miRNA与基因间的调控网络。通过一系列的验证实验证实了部分候选基因（如miRNA-33）与其靶基因（如CROT基因）的靶向调控关系，而且说明填饲引起的鹅肝脏中发生的高血糖、高胰岛素血症可能是导致miRNA表达变化的主要原因之一，继而调控靶基因，参与鹅肥肝的形成。