乙烯信号传导关键基因及互作蛋白在番木瓜后熟障碍中的作用及机制分析

Cold stress or inappropriate 1-MCP treatment may cause papaya ripening disorder where the pulp fails to soften and ripen normally. Ethylene acts as a fruit ripening-promoting hormone, but it has been rarely reported whether the block of ethylene signaling causes the ripening disorder of papaya fruit. Based on our previous QPCR reference gene screening in papaya under different stress conditions and the cloning of multiple genes for ethylene signaling, we hypothesize that the block of ethylene signaling may play an important role in papaya ripening disorder. To test this hypothesis, we plan to investigate the expression of genes related to ethylene signaling during papaya fruit ripening after cold stress and inappropriate 1-MCP treatment to elucidate the role of these signal transduction components. In addition, we aim to identify novel and important proteins that interact with ethylene signal transduction components via the yeast two-hybrid screening using 2-4 key gene as bait. The protein candidates will be further validated by GST Pull-Down, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and Co-Immunoprecipitation (Co-IP), to help illustrate the signalling mechanism and provide new strategies to control papaya ripening disorder.

低温胁迫或1-MCP处理浓度过高可导致番木瓜后熟障碍，果实不能正常软化后熟。乙烯在果蔬成熟中发挥重要作用，而乙烯信号传导与番木瓜后熟障碍的关系国内外鲜见报道。本课题组前期进行了番木瓜QPCR内参基因筛选的研究，克隆了番木瓜乙烯信号传导基因序列，我们推测乙烯信号传导受阻可能与番木瓜后熟障碍密切相关。本课题拟研究番木瓜果实经低温胁迫和过高浓度1-MCP处理后，各乙烯信号传导基因的表达特性，通过与果实硬度等生理变化的相关性分析，探明与后熟障碍密切相关的关键基因，选择2-4个作为诱饵蛋白；建立cDNA文库，通过酵母双杂交实验筛选出与番木瓜后熟障碍密切相关的乙烯信号传导关键元件互作的蛋白，探寻重要蛋白，采用BiFC、GST PullDown和Co-IP实验进行互作蛋白的验证，QPCR分析互作蛋白基因表达特征，以揭示引起番木瓜果实后熟障碍的机制, 为探寻防止番木瓜后熟障碍的新方法提供理论基础和新思路。

不适低温或1-MCP处理不当会导致番木瓜(Carica papaya L.)后熟障碍，严重影响果实的商品价值，是生产迫切需要解决的问题。本项目研究了乙烯信号传导关键基因及重要互作蛋白在番木瓜后熟障碍中的作用。.本项目克隆获得了CTR1-4、ETR1、EIN2、EIL1、EIN3a/b、EBF1/2等多个番木瓜果实乙烯信号传导元件基因全长序列并进行了基因序列生物信息学分析。.400 nl•L-1 1-MCP处理1 h的番木瓜，可以正常成熟，但比对照（0h，25℃）后熟延迟；400 nl•L-1 1-MCP处理16 h的番木瓜, 催熟后期果肉完全不能软化，出现严重“橡皮”熟现象; 细胞壁结构降解受抑制，伴有木质素的增加，细胞壁有干枯失水现象，细胞内的大液泡破碎。番木瓜EBF1、EIN2、EIN3b和EIL1/4基因的表达量在1-MCP处理时间短的（1h）的番木瓜果实中显著高于处理时间长（16h）的和对照的果实；相关性分析发现这些基因在番木瓜后熟过程中的表达与后熟有显著相关性。对1-MCP处理番木瓜后熟障碍样本的酵母双杂交cDNA文库筛库及BIFC、Pulldown验证，明确了MADS1/3与EBF1存在互作关系，这种互作可能对促进果实重要软化基因PME1和PG1的表达很重要，推测过高的1-MCP处理抑制了EBF1和MADS1/3的表达，从而影响了果实正常软化。.研究了低温逆境对番木瓜果实后熟生理生化及细胞结构等方面的影响。12℃无冷害症状；7℃ 25d 进行常温催熟，果实冷害症状和腐烂症状表现明显，果实表现不能正常软化、转黄的后熟障碍，细胞壁有木质素增加的现象。通过对生理特性指标（果肉硬度和转黄指数）与乙烯相关基因表达的相关性分析，推测ACS2、ACO1/2、CTR1/4、EIN3a/b、EBF1和ERF3可能对于番木瓜果实的转黄和软化有重要的作用，7℃低温胁迫可能会影响这些基因的表达，最后导致果实不能正常成熟。以EBF1/2为诱饵蛋白对不适低温处理番木后熟障碍样本的cDNA文库进行相互作用蛋白筛选及BiFC、Pulldown验证，发现EBF1和JAZ3互作，JAZ3和ERF9互作；Q-PCR分析发现，JAZ3表达明显受到低温抑制；推测EBF1和JAZ3共同调控ERF9表达来影响果实后熟。.研究结果揭示了引起番木瓜果实后熟障碍的机制,可为番木瓜保鲜提供指导。