外源电刺激与锌离子双重激活骨修复微球的骨再生机制研究

The activation of the osteogenesis-related pathway and the revascularization are imperative to be studied, which are the key scientific problems existed in bone regeneration. A kind of graphene/zinc silicate/calcium silicate composite microsphere loaded with the platelet rich plasma (PRP-GZC) will be prepared via the liquid-droplet method in this project. We try to use the dual activation of the exogenous electrical stimulus and the zinc ions to stimulate the human bone marrow mesenchymal stem cells up-regulate the osteogenic-related gene expressions. Furthermore, the osteogenesis mechanism under the synergistic effect of the exogenous electrical stimulus and the zinc ions will be studied in detail, and this work will help us to find the way of the activation of the osteogenesis-related pathway. In addition, we also plan to use the released platelet rich plasma to stimulate the human umbilical vein endothelial cells to up-regulate the gene expression of proangiogenic cytokine receptors, then the angiogenesis performance of the PRP-GZC will be promoted, which can provide the blood supply to meet the demands of the bone regeneration. The pore structure formed by the free accumulation of the PRP-GZC is planed to be reconstructed, and an in vitro evaluation system will be established based on the calculating data and the results of the cell experiments. Then, the suitable size of the PRP-GZC for being implanted in the bone tissue may be predicted by this evaluation system, which can provide the supporting data for the subsequent study in vivo.

成骨相关信号通路的激活与血运重建，是骨再生修复迫切需要解决的关键科学问题。本项目将采用液滴法制备一种附载有富血小板血浆的石墨烯/硅酸锌/硅酸钙复合微球（PRP-GZC），通过外源电刺激与锌离子的双重激活作用，来刺激人骨髓间质干细胞上调成骨相关基因的表达，借此深入研究外源电刺激与锌离子协同促进成骨的作用机制，旨在弄清成骨相关信号通路的激活途径。此外，通过PRP-GZC中释放的富血小板血浆，来刺激人脐静脉内皮细胞上调促血管生成细胞因子受体基因的表达，由此提高PRP-GZC的促血管形成能力，满足成骨所需的血供。重构不同球径的PRP-GZC自由堆积形成的孔道结构，建立一个由计算数据与细胞实验评价相结合的体外评判体系，由此预判骨组织适宜植入的PRP-GZC尺寸，为PRP-GZC今后开展体内植入研究提供数据支撑。

骨组织再生是一个复杂的过程，需要综合考虑多方面的因素。为了促进骨组织的再生修复，本项目借助海藻酸钠与钙离子相互交联的特性，采用液滴法研制出一种新型的还原氧化石墨烯/硅酸锌/硅酸钙(RGO/ZS/CS)骨修复微球，并从减少炎症反应、提高成骨与血管生成能力、抑制破骨分化，以及改善微球表面的细胞亲和性这几个方面，系统地研究了RGO/ZS/CS复合微球原位负载与释放盐酸万古霉素(VH)的性能、外源性电刺激与锌离子双重激活条件下小鼠骨髓间质干细胞(mBMSCs)的成骨分化行为、RGO/ZS/CS释放的功能性无机离子对新生血管生长与破骨分化的作用，以及mBMSCs在修饰有牛血清白蛋白(BSA)的氧化石墨烯(GO)表面培养时的粘附和铺展行为。研究结果显示，RGO/ZS/CS微球的球径较均一(1.82 ± 0.11 mm)，孔径分布在20 nm至1 μm，显孔隙率为48.54%；在RGO/ZS/CS复合微球制备的过程中，VH可实现原位包覆，其包封率高达30.66%，明显高于目前非原位包覆工艺制备的无机载药微球，且RGO/ZS/CS复合微球的核壳结构有助于VH的缓释。通过优化工艺参数，成功制得表面电导率为5625 S/m的RGO/ZS/CS，在外源电刺激与锌离子双重激活的条件下，mBMSCs的碱性磷酸酶活性显著提高，而且，I型胶原、骨钙素和runt相关转录因子2等成骨相关基因的表达也均显著上调；此外，RGO/ZS/CS中释放的硅和锌，能显著下调核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）的抗酒石酸酸性磷酸酶、活化T细胞核因子1、基质金属蛋白酶9和碳酸酐酶2的基因表达，并由此抑制破骨分化。当硅、锌共存时，尽管锌对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖能力有一点削弱作用，但当锌的浓度介于1.25~5 μM，硅的浓度介于34.22~137 nM时，HUVECs的体外血管生成能力显著增强。当BSA通过酰胺键共价修饰到GO表面，这能显著促进mBMSCs的粘附和铺展。综上所述，这种新颖的RGO/ZS/CS复合微球，在骨质疏松病灶区域的骨再生修复领域，具有较大的应用潜力。