富含腺苷的磷酸钙纳米球/胶原复合生物活性支架促进骨与血管再生修复大段骨缺损的分子机制

Calcium phosphate/collagen biomimetic scaffold is well known for its biocompatibility, physical properties and osteo-conductivity. However, it is not ideal for the repair of massive bone defect alone due to its insufficiency in osteogenesis and angiogenesis. Based on the results of the latest research and our previous experience that adenosine has both osteogenic and angiogenic abilities, our research will adopt ATP to establish a novel adenosine-rich calcium phosphate nanospheres/collagen bioactive scaffold. Not only the releasing pattern of adenosine but also the osteogenic and angiogenic abilities of the scaffold will be investigated in vitro. Rat critical-sized bone defect models will be constructed to further evaluate the scaffold’s osteogenic and angiogenic abilities as well as its capacity to repair the massive bone defect. Additionally, receptor suppressors will be used to unveil adenosine dependent bioactivities of the calcium phosphate nanospheres/collagen bioactive scaffold. On molecular level, specific inhibitors and siRNAs will be used to explore the molecular mechanism of osteogenesis and angiogenesis, especially PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin pathway, AMPK induction of autophagy and the promotion of Akt/GSK-3β/HIF-1α pathway. The new scaffold, with improved abilities in both osteogenesis and angiogenesis is anticipated to provide the theoretical and experimental basis for repair of massive bone defect.

磷酸钙/胶原复合仿生支架具备优良的生物相容性、力学性能及骨传导性但缺乏充分的骨诱导性及促血管生成能力，难以满足大段骨缺损的修复治疗需求。最新研究及我们的前期工作提示腺苷具有良好地诱导成骨成血管双重活性。因此，本课题拟以三磷酸腺苷为有机磷源构建富含腺苷的磷酸钙纳米球/胶原生物活性支架，通过体外实验及大鼠极限骨缺损模型评价该支架促成骨成血管活性及修复大段骨缺损能力；应用腺苷受体抑制剂明确该支架的降解产物腺苷是其发挥生物活性的分子，通过特异性抑制剂或siRNA技术进一步探讨腺苷通过调控PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路促进成骨的作用；研究腺苷通过其下游AMPK诱导自噬与促进Akt/GSK-3β/HIF-1α信号通路促进血管再生的分子机制。以期赋予富含腺苷的磷酸钙/胶原复合支架成骨成血管双重生物学活性并明确其机制，为临床大段骨缺损的修复治疗提供新的理论基础和实验依据。

研发具有高效骨修复性能的人工骨替代材料是临床骨外科发展的迫切需求，同时也具有巨大的市场前景。传统的磷酸钙/胶原复合仿生材料具有良好的生物相容性，骨传导性以及与天然骨相似的结构和化学成分等优点。然而，由于缺少成骨和成血管的诱导活性，传统的磷酸钙/胶原复合仿生支架用于骨缺损修复的效果欠佳。近期，本课题组合作团队应用其研发的微波辅助水热法，采用二磷酸果糖及三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等作为有机磷源，成功合成了具有纳米结构的系列有机磷酸钙材料。这些有机纳米磷酸钙材料较无定形多孔的无机磷酸钙材料具有更加稳定的结构、生物相容性更佳、比表面积大、降解曲线稳定等优点。并且令人惊喜的是，我们还发现以ATP 作为有机磷源合成的纳米磷酸钙其降解产生的副产品腺苷竟然能赋予该材料优良的成骨成血管的双重生物学活性。. 据此，本项目结合腺苷具有成骨成血管双重生物学活性的新发现，首先探索不同钙磷比无定形磷酸钙在培养基中的相变特点以及对干细胞成骨分化的影响，明确相变过程对成骨分化的影响及其机制，设计制备基于材料本身活性的最佳钙磷比无定形磷酸钙支架。明确了有成骨活性的最佳钙磷比无定形磷酸钙后，通过与柠檬酸甘油酯材料的复合，构建了多孔骨修复支架。在体外对材料进行了表征。之后通过活死染色，茜素红染色等细胞实验，明确了支架具有良好的生物相容性和成骨、成血管活性。最后，采用大鼠极限颅骨缺损模型，验证了支架体内的修复效果。对传统磷酸钙材料进行优化后，我们进一步以ATP为有机磷源制备磷酸钙纳米球，以ATP为有机磷源的磷酸钙纳米球降解产生的副产品腺苷能赋予该材料优良的成骨成血管的双重生物学活性。随后用临床上已经使用的纤维蛋白胶(fibrin sealant,FS)复合磷酸钙纳米球，同时结合我们的研究特色，构建了大鼠肩袖损伤修复模型，探究ACP/FS通过促进成骨成血管促进肌腱-骨愈合的效果，取得了良好的修复效果，进一步拓宽了磷酸钙材料的应用领域，为磷酸钙材料的临床应用奠定了理论基础。