14-3-3蛋白基因在黄瓜果实弯曲形成过程中的作用及机制研究

针对黄瓜生产中果实弯曲畸形导致丧失商品性而给农民造成经济损失这一实际生产问题，本项目在已经获得黄瓜果实弯曲相关14-3-3蛋白氨基酸序列的基础上，拟以果实弯曲黄瓜品种'L18-10-2'为材料，分离黄瓜14-3-3蛋白基因，并采用RNAi以及酵母双杂交技术分析14-3-3蛋白在黄瓜果实弯曲形成过程中的功能，鉴定与黄瓜14-3-3蛋白相互作用的潜在靶蛋白基因。本项目预期将揭示14-3-3蛋白基因在黄瓜弯曲果实发育过程中的分子调控机理，为培育顺直和高商品率优质黄瓜品种的分子育种奠定基础，同时也将会为其它葫芦科作物品种的遗传改良与种质创新，以及果实发育的分子调控机理研究提供理论依据。

一、课题完成情况.1.采用蛋白质组学及生物信息学的方法和技术，鉴定出与黄瓜果实发育弯曲特性紧密相关的差异蛋白7个，其中14-3-3 蛋白被定位在黄瓜第4染色体上。.2.从黄瓜果实弯曲品种‘L18-10-2’上克隆和测序得到HG14-3-3碱基序列，全长为792 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TAG，是一个高度保守的基因。14-3-3蛋白包含 263 个氨基酸，分子量是29589.287 Da，等电点为4.585。在pH7.0时，电荷为-17.58；蛋白稳定系数为48.09，是一个不稳定蛋白。该蛋白不具有跨膜结构，无信号肽，亚细胞定位显示该蛋白主要分布在细胞核上和细胞质中，其比例约为1:1，在叶绿体和线粒体上不存在；该蛋白的三维立体分子结构显示其含有9处 α-螺旋。.3.黄瓜 HG14-3-3基因在果实发育不同时期的表达分析结果表明：无论是顺直果实还是弯曲果实的腹部或脊部，HG14-3-3基因的表达量在果实开花2天时达到最大值，开花4天时基因表达量明显下降，随着果实的生长发育，HG14-3-3基因的表达量在一定范围内浮动，无明显的增加或减少趋势。在果实发育的各个时期，HG14-3-3 基因在顺直果实和弯曲果实腹部及脊部的表达量均呈现弯曲果实腹部>顺直果实>弯曲果实脊部的趋势，并且在果实发育第2天的表达量最高。推测HG14-3-3基因在黄瓜果实发育过程中的不对称表达，造成果皮或果肉细胞不对称增生而导致果实发生弯曲。.4.构建了HG14-3-3基因的过表达载体和RNA干扰载体，通过对哥伦比亚野生型拟南芥进行了遗传转化，获得T1代种子，可用于继续的功能验证研究。对黄瓜的遗传转化正在进行中。.5.基于前期实验基础上，目前正在利用遗传背景相同的高度弯曲，中度弯曲和无弯曲材料进行建库、高通量测序和数据分析，以及调控黄瓜弯曲的分子机制解析。寻找决定弯曲度的转录因子，microRNA，以及它们（包括14-3-3蛋白家族在内）对弯曲表型基因的表达调控。. 二、课题取得的成果 1. 发表论文（投稿中）3篇，其中SCI检索2篇。 2. 申报国家发明专利1项、植物新品种保护权1项，出版学术著作1部。. 3. 培养博士和硕士研究生各1名。