番茄REVOLUTA基因在果实形成过程中的功能解析

REVOLUTA (REV) gene belongs to the class III HD-ZIP gene family regulated by miR166, and plays crucial roles in the formation of apical meristem, organ polarity establishment and vascular development. However, there is no report on the function of REV during fruit formation. Interestingly, we recently found that the transgenic tomato plants, overexpressing SlREV gene by mutating the targeted sequence of miR166, exhibited phenotypes such as abnormal fruit shape and ectopic fruits. We hypothesized that SlREV may be critical in fruit formation and development. In this project, microscopic analysis and Solexa deep sequencing technology will be applied to compare the anatomical and transcriptional changes between SlREV-overexpressing and wild-type Micro-Tom tomato plants during fruit formation. Chromatin Immunoprecipitation-Sequencing (ChIP-Seq) and Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) will be employed to identify the target genes of SlREV (a putative transcription factor). Based on these data, critical genes mapped on the pathway of SlREV-regulated fruit formation will be selected for further characterization using genetic tools, such as gene overexpression and RNAi. The results will help to dissect the molecular mechanisms of SlREV-regulated fruit formation and development,and provide potential candidate genes for improving tomato by genetic engineering.

REVOLUTA（REV）属于第三类 HD-ZIP 基因家族，受miR166的剪切调控，参与顶端分生组织形成、器官极性建立、维管束发育等重要生理过程。然而，关于REV在果实形成过程中的作用尚未见报道。本项目前期研究发现，miR166剪切位点突变的番茄SlREV超表达植株表现出明显的果实形状和座果位置异常，说明SlREV参与了果实发育过程。本项目拟通过组织切片和Solexa测序技术研究野生型Micro-Tom番茄SlREV与超表达株系在果实形成过程中显微结构和基因表达谱的差异，同时利用ChIP-Seq（染色质免疫共沉淀-测序）和EMSA（凝胶迁移实验）技术寻找SlREV调控的靶基因，筛选SlREV下游与果实形成相关的关键基因，并通过超表达和RNAi技术对重要候选基因进行功能鉴定。研究结果不仅可以揭示SlREV调控番茄果实形成的基因网络，而且可为番茄的遗传改良奠定基础。

microRNA（miRNA）是一类长度约20~24个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过在转录后水平上下调或抑制靶标基因表达，从而对生物体的生长发育进行精确调控。植物miRNA在营养生长和生殖生长过程中都扮演十分重要的调控作用。miR166作为一种保守性植物miRNA，也广泛的参与了根尖的发育、茎的生长、叶片极性发育、花分生组织发育等过程，然而它对果实形成的调控机制尚不清楚。本研究以番茄作为模式植物，研究Sly-miR166及其靶标基因对花的发育和果实形成的影响，这对深入揭示花器官形态建成及果实座果、生长发育的分子机制具有重要意义。本研究主要取得以下成果：1. Sly-miR166及其靶标基因的表达模式分析发现，Sly-miR166主要在根、叶、花和果实中表达。所有靶标基因在根和茎中的表达最高，其次是在叶、花和幼果中，而在成熟果实中几乎检测不到靶标基因的表达。靶标基因在茎、叶和成熟果实中的转录水平与Sly-miR166存在互补的关系，表明Sly-miR166可能通过直接调控靶标基因在茎、叶和果实中的表达发挥重要功能。2. 在番茄果实中特异性超表达前体Sly-pre-miR166b引起心皮发育模式改变，致使果实持续内生和部分发生单性结实现象；定量结果显示，成熟Sly-miR166表达水平上升，引起所有靶基因下调，进而抑制了TAG1的表达，使花发育的确定性丧失，从而出现果中果的现象。3. 在番茄中超表达野生型靶标基因SlREV和其剪切抑制形式SlREVRis，分析发现超表达SlREVRis引起叶片极性改变、茎段维管束结构变化、花柄离层区异位花组织产生、异位心皮的发育和果实融合等表型，表明SlREV可能是多效性基因；而单独超表达SlREV却无明显表型，表明SlREV在茎、花、果实中的功能主要依赖于Sly-miR166在其转录后水平上的调控。4. 根据35S::SlREVRis对花柄离层区的重要影响，定量分析表明SlREV通过调控BLIND、GOLET、LeWUS等基因，调控分生细胞的增殖、侧生分生组织和器官边界的形成。5. Chip-seq 结果显示SlREV 直接结合到与生长素合成，信号转导和运输相关的基因上。结合表达谱结果，目前数据显示SlREV可能作为一个正调控因子通过生长素参与调节番茄的座果过程。