反相液相色谱中核酸保留行为的研究

Reversed-phase high performance liquid chromatography is one of the most suitable key technologies for the separation and analysis of nucleic acids including DNA, RNA and oligonucleotides. In this proposal, the intrinsic relationship between retention behavior and structure of nucleic acids will be investigated in different mobile phase systems. Through abundant experiment, we will systematically explore the contribution of base number, base composition, base sequence, relative position, molecule shape and secondary structure of nucleic acids on their retention. The influence of these factors on existing state and overall hydrophobicity of nucleic acids will be summarized, the interaction mechanism of nucleic acids with the stationary phase will be elucidated, and the related mathematical model will be established to describe the relationship between retention behaviors and structures of nucleic acids with accuracy. The reversed-phase liquid chromatographic behavior study of nucleic acids can not only provide a feasible theoretical guidance for the rapid selection of optimum chromatographic separation and analysis scheme, but also propose a novel strategy for the study of existing state and structure of nucleic acids in various solutions.

反相高效液相色谱是分离分析核酸包括DNA、RNA和寡核苷酸最合适也是最重要的手段之一。本项目研究在不同的流动相体系中，核酸的反相高效液相色谱保留行为和结构信息之间的内在联系。通过大量的实验，系统地探索不同碱基数量、碱基组成、碱基顺序和相对位置、分子形状和二级结构等因素对保留值的贡献，归纳这些因素对不同流动相溶液中核酸存在状态和总体疏水性的影响，探讨核酸分子与固定相之间的作用机理，建立相应的数学模型，从而更加准确地描述核酸的保留行为与各级结构之间的关系。本研究结果不但可为快速选择核酸的最佳色谱分离分析方案提供可行的理论指导，而且可为实验研究核酸在溶液中的存在状态和结构行为提供一种新颖的策略。

我们首先考察核酸分子包括DNA和寡核苷酸在TEA-AA-ACN流动相体系中的IP-RPLC保留行为，指出核酸分子尺寸不是决定保留的唯一因素，其保留既与碱基组成也与碱基序列相关。对于dsDNA，推测这与其大沟、小沟中暴露的碱基与烷基链固定相发生疏水作用有关。结果同时显示，碱基GC的含量对于dsDNA保留没有规律性的影响，而立体位阻效应会影响其在IP-RPLC中的保留行为；接着，综合估算不同碱基数量、组成、序列和相对位置、分子形状和二级结构等对保留的贡献，归纳这些因素对TEA-AA-ACN流动相溶液中核酸分子存在状态和总体疏水性的影响，建立其表观正辛醇-水分配系数（Kow”）的估算方法，探索核酸与RPLC固定相之间的作用机理；再者，通过比较寡核苷酸在等度和梯度洗脱中保留行为的差异，解释寡核苷酸产生“雪崩”现象的原因在于其在等度洗脱模型中斜率（S）非常大，微小的流动相组成（φ）变化即会导致保留因子（k）巨幅变化，并指出经典的基于小分子化合物的线性溶剂强度模型（LSS，logk=logkw-Sφ）对寡核苷酸同样适用，且基于LSS模型的梯度保留模型可用于预测寡核苷酸的保留。通过寡核苷酸的梯度保留数据推算其色谱疏水性指数（CHI），证明CHI作为一种特征性参数可以很好地预测寡核苷酸在梯度洗脱中的保留，并由此总结寡核苷酸保留行为与结构特征的关系，建立相应的数学模型；在此基础上，进一步寻找分离效率更高的流动相体系（包括其它离子对试剂、添加剂）和色谱固定相（包括整体材料、胆固醇和亲水作用色谱固定相），开展核酸分子在新色谱体系中保留行为与存在状态的关系研究；更重要的是，利用HPLC、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、LC-MS结合荧光光谱和圆二色谱技术，分离并鉴别G-四链体的不同构型，有效评估溶液环境及DNA序列对G-四链体多态性的影响，为G-四链体多态性及其生物物理性质研究提供一种简单、快速、有效的工具。综上，项目研究结果不但可以为快速选择核酸的最佳色谱分离分析方案提供可行的理论指导，而且可以为实验研究核酸在溶液中的存在状态和结构行为提供一种新颖的策略。