基于磁固相萃取的中药注射剂中蛋白质的分离分析及来源追踪

The analysis of proteins in traditional Chinese medicine injections is facing severe challenges, because traditional protein analysis methods and current Chinese pharmacopoeia method cannot meet the requirements of such related studies. Using a uniquely designed combination of functional groups, we intend to develop three novel functionalized magnetic nanocomposites by means of easy and efficient surface-initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP), Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (Cu(I)AAC), sol-gel and solvothermal methods for the magnetic solid phase extraction (MSPE) of total proteins, phosphorylated proteins and glycosylated proteins in traditional Chinese injections, respectively. Subsequently, referring to proteomics techniques, the MSPE-enriched proteins will be screened and characterized by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), as well as sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. The levels of the identified proteins will be quantified by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESI MS/MS). This proteomics technology combined with MSPE could achieve accurate qualitative and quantitative analysis of proteins in traditional Chinese medicine injections. The potential research results should be of significant importance not only for solving the mystery of adverse reactions of traditional Chinese medicine injections, but also for proposing effective solutions to remove impurity proteins and moreover ensuring the safety of traditional Chinese medicine injections.

中药注射剂中蛋白质的分析正面临着严峻的挑战，传统蛋白质分析方法和现行中国药典方法均不能满足相关研究的要求。本项目采用独特设计的官能团组合，拟通过便捷、高效的表面引发原子转移自由基聚合反应、铜催化叠氮化物-端炔环加成反应、溶胶-凝胶法和溶剂热法开发三类新颖的功能化磁性纳米复合物，分别用于中药注射剂中总蛋白、磷酸化蛋白和糖基化蛋白的磁固相萃取。然后，借鉴蛋白质组学技术，用双向电泳和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法，对经过磁固相萃取富集后的蛋白质进行筛查和定性鉴定，并采用液相色谱-电喷雾电离质谱联用对经过确证的蛋白质进行定量分析。这种结合磁固相萃取的蛋白质组学技术可以实现中药注射剂中蛋白质的精准定性和定量分析。项目的研究结果无论是对于解开其不良反应的谜团，还是为研究去除中药注射剂中杂蛋白的有效措施、确保其安全性都具有重要的意义。

为了应对中药注射剂中蛋白质分析面临的传统蛋白质分析方法和现行中国药典方法均不能满足相关研究和应用要求的严峻挑战，本项目采用磁性金属有机框架、氧化石墨烯、纳米孔碳基材料、镍基纳米氧化铁、Ti3C2Tx MXene纳米片等基体材料的独特设计，以及单金属/双金属、氨基/胍基、双磷酸果糖、硼酸、壳聚糖等功能位点的灵活组合，通过便捷、高效的溶剂热法、有机分子辅助法、超声辅助法、原位氧化法、低温冷冻模板法等合成及修饰策略，发展了包括以钴/镍双金属有机框架为前驱体的磁性纳米孔碳基材料、基于有机分子辅助合成Fe3O4纳米粒子的磁性氧化石墨烯、基于铪/钛双金属有机骨架的胍基功能化磁性纳米复合物、钛固定化双磷酸果糖修饰磁性锆金属有机框架材料、磁性镍基氧化铁纳米复合物、磁性Ti3C2Tx MXene纳米片、硼酸修饰磁性锆金属有机框架材料、亲水性多孔磁性氧化石墨烯/壳聚糖复合物等新型纳米材料，用作磁固相萃取吸附剂，单独或顺序分离富集低丰度肽、磷酸化肽和/或糖基化肽、单磷酸化肽和全磷酸化肽。通过对材料的综合表征，解析其形貌和结构特征、化学组成、官能团类型，同时通过对肽段保留-洗脱选择性的考察，确定磁性纳米复合物与不同肽段相互作用的物质基础，并推断其作用机理，从而基于疏水、固定金属离子亲和色谱、金属氧化物亲和色谱、亲水作用色谱、硼亲和等作用以及它们的协同作用对肽段进行富集，以提高材料对不同肽段的分离效率。接着采用蛋白质组学技术包括基质辅助激光解析-飞行时间质谱对所富集的肽段进行鉴别，并实际应用于中药注射剂中蛋白质的筛查分析。另外，还开展了其它功能化材料如杯芳烃修饰大介孔二氧化硅微球、两性离子甜菜碱不锈钢整体柱、通用型金纳米粒子修饰毛细管杂化整体柱研制及蛋白质分离富集应用的研究工作。项目的研究结果无论是对于打开中药注射剂中不良反应的黑箱，还是为开发消除其中杂蛋白的有效措施、保障中药安全都提供了有力的支撑。