Aquaporin 4通过Connexin 43阻断血脑屏障损伤的作用及机制研究

AQP4在神经发育过程中和血脑屏障关系密切，我们最近用AQP4基因敲除小鼠进行实验，结果发现AQP4敲除后影响了脑缺血和出血的血脑屏障通透性，提示AQP4蛋白和血脑屏障损伤有密切联系（结果已发表）。然而AQP4仅特异表达于星形胶质细胞膜上，它是怎么影响到血脑屏障的内皮细胞及紧密连接？我们的前期研究表明：脑缺血后AQP4影响血脑屏障并没有通过分泌性蛋白这一途径；最新研究表明缝隙连接蛋白Connexin 43不但有细胞间通讯作用（传递第二信使），还引起血脑屏障通透性改变。AQP4是否通过Connexin 43对血脑屏障产生影响？其机制又是什么？这是我们申请本项目的初衷，本项目拟全面研究多种脑缺血条件下AQP4对血脑屏障的作用，并透过Connexin 43阻断实验分析其机制，并层层递进研究Calpain和钙离子在其中的作用；同时用蛋白组学方法探索性研究AQP4抑制后下游可能出现的新靶点蛋白。

背景：水通道蛋白（AQP4）在脑水肿的形成和清除中起到重要作用。我们前期的研究表明，AQP4与血脑屏障（BBB）关系密切，但其中的机制尚不明确。缝隙连接蛋白43（Cx43）在细胞间通讯中起到重要作用，但在脑缺血中作用仍有争议，可能与其两种活化形式：磷酸化及重分布有关系。本课题主要研究AQP4对脑缺血后BBB的作用及其是否与Cx43相关，并是否通过钙蛋白酶（Calpain）介导。同时研究促红细胞生成素（EPO）对脑缺血后神经血管单元（NVU）的效应及其与Cx43的哪种活化形式相关。. 方法：我们使用AQP4及Cx43基因敲除小鼠，研究大脑中动脉栓塞（MCAO）后AQP4、Cx43的表达及其对BBB的作用。并制作体外BBB模型，观察Cx43干扰及过表达后BBB通透性的影响。使用不同小鼠来源的细胞，观察AQP4对Cx43的作用是否通过Calpain介导。同时使用多种抑制剂，研究Cx43的活化形式在EPO对NVU效应中的影响。. 结果：我们的研究发现，脑缺血后AQP4表达显著增加，AQP4基因敲除可加重小鼠神经功能缺损，增加死亡率，增加脑水肿及伊文思蓝渗漏，并使得紧密连接开放及内皮细胞肿胀。免疫荧光及Western blot均显示，脑缺血后Cx43表达增加，AQP4基因敲除小鼠Cx43表达水平低于野生型小鼠。Cx43基因敲除可加重脑缺血后BBB形态及功能的破坏。体外BBB模型氧糖剥夺（OGD）后，加入AQP4 siRNA可增加野生小鼠来源细胞BBB通透性，但对Cx43基因敲除小鼠来源细胞无作用。野生小鼠星形胶质细胞OGD后，Calpain抑制剂、siRNA干扰可下调Cx43及磷酸化Cx43 mRNA及蛋白表达，Calpain过表达增加两者表达。而AQP4基因敲除小鼠中无类似效应。EPO在脑缺血后上调p-Cx43而非总Cx43表达，进而减少钙离子及谷氨酸传递，起到保护BBB，增加NeuN及CD31，减少GFAP表达的效应。. 结论：本课题结果提示，AQP4通过Calpain介导，影响Cx43表达，进而起到保护脑缺血后BBB的作用。EPO在脑缺血后通过上调p-Cx43，改善缝隙连接信息传递，减少毒性物质，起到保护NVU的作用。本实验结果为脑缺血后BBB影响机制提供理论依据，同时为缺血性卒中的治疗提供作用靶点，可能为新药的研制提供新的思路。