黄芪中天然硝化抑制剂及其作用机理研究

本项目2009年获得1年期资助，现申请延续。预研究表明，黄芪根粗提液中含有抑制土壤硝化活性和种子发芽的作用，表明其中含有天然硝化抑制剂和化感物质。过去有关黄芪的研究主要集中在中医药方面，对于黄芪中含有天然硝化抑制剂，除了本实验室的一篇报道以外，未见有类似的其它报道。广泛调研中药、化感作用、硝化作用、豆科固氮四个方面的已有文献，按照已报道的化合物化学结构的相似性，分析并提出"类黄酮可能是黄芪中天然硝化抑制剂"的假说。在此基础上，本项目拟进一步研究类黄酮抑制硝化活性的作用机理、类黄酮化学结构与抑制效果之间的关系。学科交叉是本项目主要特点。研究结果对其它学科有借鉴作用，为探索新的天然硝化抑制剂提供新的信息。

先前的研究表明，黄芪根粗提液中含有抑制土壤硝化活性和种子发芽的作用，表明其中含有天然硝化抑制剂和化感物质。过去有关黄芪的研究主要集中在中医药方面，对于黄芪中含有天然硝化抑制剂，除了本实验室的一篇报道以外，未见有类似的其它报道。广泛调研中药、化感作用、硝化作用、豆科固氮四个方面的已有文献，按照已报道的化合物化学结构的相似性，分析并提出“类黄酮可能是黄芪中天然硝化抑制剂”的假说。本项目的目的是验证所提出的假说并进一步揭示类黄酮抑制硝化活性的作用机理。首先，经提取纯化从黄芪中成功获得有相当纯度的刺芒柄花素(Formononetin， 分子式C16H12O4，分子量268.26)和芒柄花苷(Ononin，分子式C22H22O9，分子量430.41)，两者都属于类黄酮。接着，用化学标样为对照，用连续驯化30个月的硝化污泥为生物测试材料，检测黄芪中分离到的刺芒柄花素和芒柄花苷对硝化活性的抑制作用。结果表明，黄芪中分离到的刺芒柄花素和芒柄花苷与对应的标样几乎完全抑制了硝化污泥的硝化活性，证明了我们此前提出的假说。随后，我们进一步证明芒柄花素和芒柄花苷对硝化活性的抑制作用是可逆的，说明抑制作用并非源自添加物对细胞的毒害，而是抑制了氨氧化单加氧酶(amoA)活性。在受类黄酮抑制的样品中加入过量的Cu，硝化活性不能恢复，说明类黄酮抑制硝化活性不是通过金属元素络合/螯合作用而发生作用。向系统中添加竞争性底物乙烯，当乙稀浓度为0~0.9 mM时，硝化活性均能恢复到接近原始水平；当乙烯浓度为1.2 mM时，硝化活性只能恢复到原始水平的42%左右，说明类黄酮抑制硝化活性是通过底物竞争来实现的。这就是类黄酮抑制硝化活性的机理。