高粱分泌生物硝化抑制剂MHPP的调控机理研究

硝化作用是造成土壤氮素损失的重要途径。某些植物能够分泌具有抑制硝化作用的物质，称为生物硝化抑制剂。高梁是农作物中唯一能够大量分泌生物硝化抑制剂的品种，该物质为4-羟基苯-3-甲基丙酸（MHPP）。研究发现，施用铵态氮时，MHPP大量分泌，而在硝态氮处理下分泌减少，但是根系中MHPP的含量却差异不大。因此，MHPP的分泌受到细胞膜上运输系统的调控，但是相应的生理与分子机制还不明确。由于MHPP是通过膜上阴离子通道运输的，因此其外流取决于细胞膜质子泵建立的膜电位。因此本项目拟研究在不同氮素形态下，高粱根系细胞膜质子泵活性与MHPP分泌之间的关系。同时构建蛙卵异源表达系统，研究质子泵与MHPP阴离子通道之间的调控作用。最后，构建质子泵基因超表达的转基因高梁，检测MHPP分泌能力的变化。本项目将阐明植物分泌生物硝化抑制剂的调控机制，并为生产中利用生物硝化抑抑制剂来提高土壤氮素利用率提供理论依据。

土壤中的硝化作用不仅导致硝态氮大量淋失，还会引起后续的反硝化作用产生氧化亚氮，不仅造成了严重的环境污染，同时也降低了氮肥利用率。生产上可施用硝化抑制剂，但是应用成本较高。因此种植能够分泌硝化抑制物质的农作物不仅具有应用价值而且其本身还具有经济价值，值得推广。高粱是农作物中发现的可以大量分泌多种生物硝化抑制剂（简称BNI），其中比较明确的是对羟基苯甲酸MHPP。本项目主要从生理、分子和田间应用三个方面进行了相关的研究.（1）不同氮素营养下高粱分泌生物硝化抑制剂的差异及其原因.在铵和硝营养下培养高粱，收集根系分泌物，通过荧光标记的氨氧化细菌测定其中硝化抑制物质的活性，结果表明，铵态氮营养下根系分泌大量的BNI，而在硝态氮营养下几乎没有分泌。用HPLC测定其中的MHPP含量也有类似的结果。我们通过超速离心分离细胞膜，测定了与物质运输相关的质子泵活性，结果表明质子泵活性与MHPP为主的生物硝化抑制物质的分泌之间密切相关。通过高通量测序并结合PCR验证，我们发现相关的MHPP转运基因与质子泵基因表达模式相似。通过将MHPP转运蛋白的候选基因异源转化到酵母细胞后测定膜电位，结果发现其转运受到质子泵所建立的膜电位影响。最后，我们构建了质子泵基因SbHA1超表达的高粱，并在T1株系中检测到其提高根系分泌BNI的现象，从而验证了质子泵在调控BNI分泌过程中的作用。.（2）生物硝化抑制剂对土壤中硝化作用的抑制效果研究.我们通过三年的大田实验种植高粱，以玉米为对照植物，采用单作与间作的种植方式，并以硝化抑制剂 NITRAPYRIN的施用为参照。通过定点检测土壤中铵、硝含量变化，温室气体氧化亚氮的排放，验证生物硝化抑制剂在土壤中的作用效果。并采集土壤DNA，测定了氨亚化细菌和氨氧化古菌的数量与种群变化。结果表明，种植高粱的土壤中铵态氮停留时间长，并且氨氧化细菌与氨氧化古菌的数量和种群都有减少，氧化亚氮的排放也降低。.这些研究结果为农业生产中推广应用生物硝化抑制剂提供了重要的依据。