TFPI基因修饰内皮祖细胞靶向多途径防治血管再狭窄的实验研究

冠心病是严重威胁人类健康的重大疾病，经皮腔内冠状动脉成形术和血管支架植入可以使95%接受治疗的病人冠脉血流恢复正常，但血管再狭窄的发生严重影响了其远期疗效，因此非常必要寻找更加有效的治疗方法。近年来以干细胞为载体的基因治疗因具有向靶病灶定向迁移等优点而受到了极大的关注。本项目拟通过体外转染的方式将TFPI基因导入内皮祖细胞，将内皮祖细胞归巢特性、修复受损内皮的功能与TFPI抗血栓、抗炎症、抗平滑肌细胞增殖的功能有机结合起来，实现对血管再狭窄的靶向和多途径防治（抗血栓、抗增殖、抗炎症、促进内皮愈合）。研究其在血管损伤大鼠体内的归巢特性、对血管内皮损伤修复的能力以及对血管再狭窄发生的防治作用，探讨TFPI基因修饰的内皮祖细胞用于血管再狭窄防治可行性，为基因治疗和干细胞治疗联合用于人类血管再狭窄防治提供理论依据和实验基础，具有重大的理论价值和应用前景。

血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞具有定向迁移分化为成熟血管内皮细胞的能力。参与出生后的血管生成和血管发生，近年来血管内皮祖细胞被广泛用于治疗血管再狭窄、缺血性心血管疾病和组织工程血管生成的研究中。本项目探讨了基因修饰的内皮祖细胞在血管再狭窄防治和促进组织工程血管化方面的可行性。具体研究内容和研究成果如下：.1、分别从人脐带血、外周血、大鼠骨髓分离单个核细胞，用特定的诱导培养基在体外培养、扩增血管内皮祖细胞。通过观察其生长过程中的形态改变、检测EPCs的功能和表面标志来进行鉴定。结果显示，结果证实分离培养后得到的细胞是相对纯度较高的血管内皮祖细胞。.2、成功构建了包括人类组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白的真核双表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI，使得人类组织因子途径抑制因子和绿色荧光蛋白的基因从同一个双顺反子mRNA互不干扰地同时表达，实现了通过观察绿色荧光蛋白即可确定人类组织因子途径抑制因子表达的目的，并保证细胞内表达的人类组织因子途径抑制因子能有效分泌到细胞外，为人类组织因子途径抑制因子用于疾病防治研究提供了有效研究工具。.3、考察了脉冲电磁场对内皮祖细胞的增殖、分化的作用。结果显示对于不同初始浓度的内皮祖细胞，脉冲电磁场对内皮祖细胞的活力没有明显的影响，与未经脉冲电磁场作用的对照细胞的活力相比基本上没有区别，具有良好的细胞活力。而脉冲电磁场对内皮祖细胞的分化没有产生非常明显的影响，较好的维持了内皮祖细胞的表面标志。.4、考察了VEGF修饰的内皮祖细胞对工程化组织血管化的作用及TFPI修饰的内皮祖细胞对血管再狭窄的防治作用。结果显示，VEGF基因修饰的内皮祖细胞对工程化组织的血管化有较为明显的促进作用，而对机体没有引起明显的炎症反应。血管体内初步实验结果显示TFPI基因修饰的内皮祖细胞对大鼠血管内皮的损伤具有较好的修复作用。