改良型TAT-Apoptin重组减毒鼠伤寒沙门菌协同抗肿瘤机制研究

TAT-apoptin has been demonstrated that it could improve the possibility of the application of Apoptin proteins for anti-tumoral medicines. However, problems with the route of administration and effective antigen presenting system for TAT-apoptin have not been completely resolved. Attenuated Salmonella typhimurium plays a significant role on acting as cancer antigen delivery vectors, and it can be selectively accumulated in tumor tissue. Therefore, we constructed a recombinant attenuated Salmonella typhimurium strain ΔcrpΔasdSL1344 (PYA-TAT- Apoptin) which was stablely carrying and expressing TAT-Apoptin genes by host-vector balanced-lethal system. The melanoma cell lines B16F10 and lung cancer cell lines LL/2 were infected by the recombinant Salmonella. Mouses bearing melanoma and lung cancer models were constructed and they were also infected by the recombinant Salmonella by oral. Then the positioning expression of the TAT-apoptin, the cancer apoptotic characteristics, apoptosis signaling pathways, and the tumor suppressor effect induced by Salamonella carrying TAT-Apoptin were explored. This report might provide new ideas for treatment of cancers induced by the attenuated Salmonella and Apoptin.

鉴于改良型TAT-Apoptin利用TAT转导功能提高Apoptin蛋白的抗肿瘤作用研究受限于给药途径与有效的抗原递呈系统的支撑，而减毒鼠伤寒沙氏菌不仅可作为肿瘤基因治疗的载体，并且能够选择性积聚在肿瘤组织。本项目在前期研究减毒鼠伤寒沙门菌载体平衡系统和改良型TAT-Apoptin的基础上，拟构建能稳定携带改良型TAT-Apoptin的重组减毒沙门菌∆crp∆asdSL1344(PYA-TAT-Apoptin)，以体内外感染黑色素瘤细胞株B16F10和肺癌细胞株LL/2及其引起的荷癌鼠肿瘤为模型，观察重组菌携带TAT-Apoptin在不同肿瘤细胞内的定位表达，明确其凋亡特性，探索可能的凋亡信号通路，分析体内抑癌情况，最终探明减毒鼠伤寒沙门菌稳定携带改良型TAT-apoptin在体内外协同抗肿瘤作用，从而为减毒沙门菌协同Apoptin在肿瘤治疗的应用提供新的思路与途径。

凋亡素(Apoptin)可选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。然而，天然状态下的Apoptin很难透过细胞膜屏障诱导肿瘤细胞凋亡。HIV-1的反式激活因子TAT能高效快速地跨膜转运与之融合表达的蛋白并使之进入细胞；此外，减毒鼠伤寒沙门菌可作为肿瘤基因治疗的载体，能够选择性聚集在肿瘤组织。因此，本项目利用减毒鼠伤寒沙门菌载体平衡系统构建能稳定携带TAT-Apoptin基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌，感染小鼠黑色素瘤细胞B16F10和小鼠肺癌细胞LL/2及其引起的荷癌鼠肿瘤模型，观察分析其在体内外的抗肿瘤作用。围绕此，目前已取得如下以下研究进展和结果：1. 成功扩增改良型TAT-Apoptin基因，并构建了能稳定携带TAT-Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌△crp△asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)，其生长速度与强毒株SL1344相比明显减慢，与缺失株△crp△asdSL1344及互补菌株△crp△asdSL1344(pYA3493)基本一致，且该TAT-Apoptin融合蛋白可在减毒鼠伤寒沙门菌中进行分泌性表达；2. 将重组减毒沙门菌体外感染黑色素瘤细胞B16F10和肺癌细胞LL/2，Western-blot可检测出细胞内TAT-Apoptin蛋白条带，同时利用CCK-8、AnnexinV/PI流式细胞术和TUNEL染色技术证实重组减毒鼠伤寒沙门菌能够诱导体外B16F10和LL/2细胞凋亡；3. 通过体外感染肿瘤细胞B16F10细胞和LL/2细胞，探索诱导主要的信号蛋白发现Caspase-3/6/8/9和细胞色素C等相关信号蛋白参与了重组减毒鼠伤寒沙门菌诱导的B16F10和LL/2细胞凋亡，并且研究发现肺癌细胞LL/2凋亡还与炎症相关因子Caspase-1的介导有关；4. 通过感染荷癌鼠肿瘤模型发现，改良型TAT-Apoptin重组减毒鼠伤寒沙门菌能够在B16F10黑色素肿瘤和LL/2 肺癌小鼠肿瘤组织中增殖，且能够抑制肿瘤的生长及延长肿瘤小鼠生存期。综合以上结果，本研究不仅为重组减毒鼠伤寒沙门菌平衡致死系统携带改良型TAT-Apoptin的抗肿瘤机制研究奠定了理论基础，同时为探索Apoptin在肿瘤治疗与应用提供了借鉴。