与膜联蛋白A7相互作用蛋白的鉴定及其调节血管内皮自噬的机制研究

In our previous researches, we found that annexin A7 and a 3'UTR-derived RNA (uaRNA) were involved in vascular endothelial cell (VEC) autophagy. However, the mechanisms by which they regulate VEC autophagy are not clear. To find new clues for answer the question, we performed yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation experiments in our preparative works. The results showed that annexin A7 (ANXA7) could interact with grancalcin（GCA）and T-cell-restricted intracellular antigen-1 (TIA-1). It has been reported that TIA-1 can bind with RNA so as to regulate cell survival and apoptosis. Based on our previous research data and preparative experiments, we will further identify the interactions of ANXA7, GCA and TIA-1 during VEC autophagy; investigate the functions of GCA and TIA-1 in VEC autophagy; study the mechanism by which GCA and TIA-1 regulate VEC autophagy through interaction with ANXA7; explore the interaction between TIA-1 and the uaRNA and its effect on VEC autophagy. By these researches, we will provide evidence for explaining the mechanisms of VEC autophagy, and suggest new strategies for prevent and therapy of vascular diseases.

在前期工作中，我们发现Annexin A7 (ANXA7)和一种uaRNA（3'UTR-derived RNA）是调节血管内皮细胞（VEC）自噬的关键因子，但是，其作用机理并不清楚，为了找到解决该问题的新切入点，我们在预实验中，利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术，了解到ANXA7与Grancalcin（GCA）和 T-cell-restricted intracellular antigen-1 (TIA-1)可以相互作用，已知TIA-1是RNA结合蛋白。在此基础上，我们拟进一步鉴定在VEC自噬中ANXA7与GCA和TIA-1的相互作用； 研究GCA和TIA-1在VEC自噬中的功能；研究GCA和TIA-1与ANXA7的相互作用影响VEC自噬的机理；研究TIA-1与该uaRNA的相互作用及其对VEC自噬的影响。为阐明VEC自噬的调控机理提供新的实验证据，为血管疾病的防治提供新靶点和线索。

为了深入研究细胞自噬的调控机制。我们在先前发现膜联蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）是调节血管内皮细胞（VEC）自噬的关键因子的基础上，利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术，了解到ANXA7与粒钙蛋白（grancalcin, GCA）和RNA结合蛋白—T细胞抗原1(T-cell-restricted intracellular antigen-1,TIA1)可以相互作用。但是，GCA和TIA1在自噬过程中发挥什么作用？它们的相互作用又如何调节血管内皮细胞自噬过程？均不清楚。同时，我们发现一种来自TGF-beta2的 3’UTR的一种长非编码RNA（lncRNA）—TGFB2-OT1能以mTOR非依赖的方式促进VEC自噬。但是，TIA-1是否通过与TGFB2-OT1相互作用调节VEC自噬并不清。.为了回答上述问题，我们研究了ANXA7与GCA和TIA-1的相互作用及其对自噬的影响；研究了GCA和TIA1与ANXA7的相互作用影响VEC自噬的机理；研究了TIA1与TGFB2-OT1的相互作用及其对VEC自噬的影响。重要结果：1）化学小分子ABO (6-amino-2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-1,4-benzoxazine)能直接靶向ANXA7，通过抑制Thr286的磷酸化抑制其GTPase活性；2）ABO能促进ANXA7和GCA相互作用、抑制了GCA磷酸化、降低了细胞内Ca2+水平，同时，ABO促进ANXA7与LC3-II相互作用，抑制LC3-II的磷酸化，因此促进自噬；3）新鉴定的自噬抑制剂—3BDO（3-苄基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁内酯）3BDO是mTOR的激活剂，3BDO通过促进TIA1的磷酸化，降低TGFB2-OT1的加工，但不影响TGF-beta2表达；4）TGFB2-OT1通过与靶向ATG13的miRNA-4459结合，提高ATG13的蛋白水平,因此促进自噬；5）NUPR1 和TIA1可以调控TGFB2-OT1的表达，而TGFB2-OT1可以通过结合分别靶向CERS1，NAT8L和LAPR1的MIR3960，MIR4488和MIR4459，从而调控了这些在自噬和炎症中发挥重要作用的蛋白，因此将血管内皮细胞自噬和炎症关联在一起。这为阐明VEC自噬的调控机理提供了新的实验证据，为血管疾病的防治提供了新线索。