磷脂酰胆碱特异性磷酯酶C在血管内皮细胞自噬中的作用及机理研究

本课题组的先前研究结果表明，磷脂酰胆碱特异性磷酯酶C（PC-PLC）是参与血管内皮细胞自噬的重要因子，但是PC-PLC如何发挥作用并不清楚。为了找到搞清该问题的切入点，我们利用免疫共沉淀结合质谱分析方法，寻找了可能与PC-PLC结合的蛋白，结果表明，磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP1）和ATP合成酶α亚基前体可能与PC-PLC结合。鉴于磷脂酰乙醇胺在细胞自噬启动和双层膜小体形成过程中的重要性，我们推断PC-PLC可能通过PEBP1发挥作用。为了证明此假设，我们将利用免疫共沉淀、蛋白质在细胞内的共定位和PC-PLC活性分析方法证明两者的关系；利用PEBP1的shRNA和基因过表达技术，结合PC-PLC的抑制剂和活性增强方法，通过PC-PLC的活性分析，证明两者在调节血管内皮自噬中的功能和关联机理。为阐明血管内皮自噬的分子机制提供新的实验证据，为心血管病的治疗提供新线索。

本项目旨在研究磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（phosphatidylcholine-specific phospholipase C, PC-PLC）和磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（Phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）在血管内皮细胞（VEC）自噬中的功能，以及PC-PLC与PEBP1在调节VEC自噬中的关系。我们已按着计划完成了研究工作，同时，鉴于自噬过程的复杂性以及自噬调控的多方向性，PC-PLC与PEBP1调控VEC自噬的完整信号途径以及与其有关的自噬相基因的靶蛋白依然未知。因此，我们结合本实验室的先前研究成果，进一步研究了多种自噬相关基因表达及其与PC-PLC和PEBP1的相互关系，为阐明PC-PLC与PEBP1调控自噬的分子机制提供了新的证据。.在本项目中，我们首先发现PC-PLC的抑制剂D609能诱导血管内皮细胞自噬。PC-PLC抑制剂D609引起的血管内皮细胞自噬为mTOR非依赖型。PC-PLC抑制剂D609通过下调PEBP1引起血管内皮细胞自噬水平升高。在发现PEBP1参与PC-PLC介导的自噬的情况下，证明了PEBP1能负调控血管内皮细胞自噬。.目前动物和人的PC-PLC基因尚未被克隆出来，因此，找到内源性的PC-PLC活性的正负调控因子具有重要理论和实际意义。我们证明PEBP1能与PC-PLC相互作用，而且PEBP1能增强PC-PLC的活性。在本项目中，我们发现在动脉硬化发展过程中， PEBP1在斑块和血清中的水平都升高，用PC-PLC的抑制剂D609抑制动脉硬化发展时，PEBP1的水平显著下降。说明PEBP1可能是动脉硬化发生发展的重要标志物。.鉴于血管内皮细胞自噬水平的变化对动脉硬化的发展具有重要影响，我们利用动脉硬化小鼠模型（apoE-/-小鼠）和oxLDL处理的体外培养的血管内皮细胞模型，在体内外，研究了ANXA7和PC-PLC在血管内皮细胞自噬调控过程中的上下游关系，以及该信号通路与动脉硬化的关系。发现靶向ANXA7的ABO能显著提高斑块内皮层自噬水平和ANXA7的蛋白水平, 并降低了导致动脉硬化斑块不稳定的PC-PLC的活性。进一步在细胞水平上研究发现ANXA7可以抑制PC-PLC活性，说明ANXA7是PC-PLC活性的负调控因子。