短小蛇根草中水杨酸高效调控喜树碱合成的分子机制研究

Camptothecin (CPT) and its derivatives, known as one of the "Three important anti-cancer drugs in 21th century" for their high anti-tumour activity and unique mechanism, are widely used in the treatment of many kinds of cancer and leukemia. However, extraction from the limited natural plants is still the main reliable source of CPT production at present, far from meeting the market demand. As a camptothecin-producing herb, Ophiorrhiza pumila is able to provide a candidate way of CPT yield by its hairy roots culture system. It has been proved that salicylic acid (SA) can remarkely enhance the camptothecin content of Ophiorrhiza pumila hairy root, but the molecular mechanism of this regulation is not clear yet. On the basis of optimizing Ophiorrhiza pumila hairy roots induction, this project intend to analyze the correlation of CPT pathway genes expression levels and the alkaloid accumulation, using the lastest transcriptome method RNA-sequencing as well as real-time quantitive PCR and HPLC. This work aims to indentify the genes encoding key enzymes (or transcription factors) involving in the SA regulation of CPT synthesis with in situ hybridization and subcellular localization, and then confirm their role in the pathway by various means including heterotopic expression and transgene, in order to reveal the molecular mechanism of SA regulation, and finally to to lay the foundation and provide scientific basis for improving the CPT content in Ophiorrhiza pumila and remitting clinical medicine demand in the future.

喜树碱及其衍生物因其很强的抗肿瘤活性和独特的抗癌机理，被称为21世纪三大抗癌药物之一，市场需求十分巨大。然而目前喜树碱来源有限,远不能满足市场的需要。短小蛇根草作为产喜树碱的多年生草本植物，其毛状根系统是获取喜树碱的一种候选途径，而水杨酸（SA）能显著提高毛状根中喜树碱产量，但其分子调控机理尚不清楚。本项目在优化短小蛇根草遗传转化体系的基础上，拟应用最新转录组学手段（RNA-seq）结合荧光定量RT-PCR 和HPLC等技术，比较分析水杨酸（SA）诱导前后喜树碱合成相关基因表达与喜树碱积累的相关性；结合原位杂交和亚细胞定位技术，深入分析基因表达模式，确定SA调控喜树碱生物合成的关键酶基因（或转录因子），同时用体外表达及转基因等方法确认关键基因在喜树碱生物合成中的作用；以期揭示SA调控喜树碱生物合成的分子机理，为今后提高短小蛇根草中喜树碱含量及缓解临床需求奠定基础和提供科学依据。

喜树碱及其衍生物因其很强的抗肿瘤活性和独特的抗癌机理，被称为21 世纪三大抗癌药物之一，在多种癌症及白血病的治疗中广泛使用，市场需求十分巨大。短小蛇根草是产喜树碱的多年生草本植物，本项目在优化短小蛇根草遗传转化体系的基础上，应用转录组学手段结合荧光定量RT-PCR 和HPLC 等技术，比较分析喜树碱合成相关基因表达与喜树碱积累的相关性，获得200多条可能与喜树碱合成相关的unigenes序列。. 克隆获得喜树碱合成途径中编码16个相关酶（TSB，HMGS，HMGR，IPPI，DXS，DXR，GPPS，G10H，HGO，SLS，DLGT，DLH，IDS，IO，LAMT，SGD）的19条基因全长序列，并完成了关键酶基因特征分析。完成了对短小蛇根草毛状根中不同生长周期中的喜树碱合成情况的检测。研究显示喜树碱可能参与毛状根的生长发育，或者受发育相关基因的调控。对已知的所有关键酶基因在短小蛇根草毛状根中不同生长时期表达水平进行分析，根据基因表达水平和喜树碱合成变化趋势的相关性，筛选获得部分喜树碱合成中比较重要的关键酶基因。. 通过体外表达及转基因等方法完成喜树碱生物合成关键酶基因G10H，10-HGO，SLS的功能分析和作用确认，并获得高产喜树碱的短小蛇根草毛状根株系。研究结果显示SLS和G10H在喜树碱合成中均具有重要作用，而且SLS可能比G10H在短小蛇根草的喜树碱合成途径中具有更重要的作用，组合利用SLS和G10H可以进一步提高短小蛇根草中的喜树碱含量。而10-HGO基因在短小蛇根草的喜树碱合成途径中可能处于次要地位，只是一个有益的补充，8-HGO基因很有可能在短小蛇根草的喜树碱合成途径中占据更重要的地位。细胞实验显示转基因株系中的喜树碱活性与非转基因株系中喜树碱活性具有相同的抑癌活性。. 克隆获得了部分关键酶基因的启动子序列，并进行了作用元件分析。并克隆获得了部分短小蛇根草中喜树碱合成相关转录因子序列，分别来源于bHLH，ERF，WRKY，JAZ和MYB转录因子家族。经过生物信息学分析和实验验证，选择部分转录因子正在进行调控机制研究。. 通过本研究获得高产喜树碱的新种质，可以考虑作为新型喜树碱药源替代材料，既可以降低该药物的生产成本，又有利于环境保护。本项目为今后提高短小蛇根草中喜树碱含量及缓解临床需求奠定基础和提供科学依据。