黄花苜蓿耐寒分子机理研究

苜蓿是最重要的豆科牧草，低温是限制苜蓿及其它豆科牧草生产的主要环境因子之一，影响了苜蓿的生长和产量，培育秋眠程度低而又耐寒的新品种是近年来苜蓿育种的重要目标。但目前对苜蓿耐寒性的分子机理了解非常有限，影响了苜蓿耐寒育种进程。黄花苜蓿是一种比紫花苜蓿更耐寒的种质资源，遗传背景与紫花苜蓿接近，揭示其耐寒性的分子机理，有助于苜蓿耐寒高产新品种的定向培育，可为苜蓿及其它豆科牧草耐寒性的遗传改良提供理论依据。但国内外对黄花苜蓿耐寒性研究很少。本项拟通过比较黄花苜蓿与不耐寒紫花苜蓿品种低温诱导基因表达的差异，获得黄花苜蓿特异的响应低温胁迫的转录组，从中筛选出与苜蓿耐寒性相关联的耐寒基因，进而分离和鉴定一些重要的耐寒基因，并深入研究这些基因的分子特性及其调控耐寒性的分子机制，从而揭示黄花苜蓿耐寒性分子机理。因此，本项目不仅具有重要理论意义，也有广阔的应用前景，为牧草分子育种提供耐寒基因和遗传标记基因。

对照原计划的研究内容，本项目开展了以下几方面研究：（1）以抑制性消减杂交（SSH）方法，比较并筛选出黄花苜蓿与紫花苜蓿在响应低温过程中差异表达的基因；还进行了全基因组水平的黄花苜蓿与截型苜蓿差异响应低温的Solexa表达谱分析，通过对基因功能、代谢通路分析及差异表达基因的聚类分析等，全面地解析了黄花苜蓿耐寒相关基因网络。（2）以黄花苜蓿与紫花苜蓿的杂交后代为材料，重点比较分析了抗寒性强、中等和抗寒性弱的材料中糖代谢基因及转录因子ERF基因的表达，观察到它们与苜蓿耐寒性有关。（3）从低温处理的黄花苜蓿叶片克隆了MfMIPS1、MfGolS1、MfHyPRP、MfELIP、MfSAMS1、MfTIL、MfINT、MfERF、MfPIP2-7、MfcpCOR14等10个抗寒候选基因，分析了它们响应低温的表达及参与的信号途径，以转基因植物鉴定了这些基因的耐寒性及对其它逆境的耐性，并对部分基因调控黄花苜蓿抗寒性的机制进行了研究。结果表明：MfTIL表达只受低温诱导，其他基因受低温、干旱或（和）盐胁迫的诱导。MfMIPS1、 MfGolS1和MfINT的表达不受ABA影响，但受糖的诱导；MfHyPRP、MfELIP、MfSAMS1、MfTIL、MfPIP2-7和MfcpCOR14等基因的表达受ABA诱导，MfMIPS1、MfHyPRP和MfSAMS1等基因受H2O2和一氧化氮（NO）的诱导。研究还证明，ABA参与低温诱导MfEILP和MfTIL的表达；NO参与低温和干旱诱导MfHyPRP基因的表达，H2O2和NO共同作用，参与MfMIPS1的诱导，ABA、H2O2与NO共同作用，参与低温和干旱诱导MfSAMS1的表达。过量表达MfTIL和MfcpCOR14的转基因烟草提高了抗冻、抗冷性，对抗旱、抗盐性影响不大；其他基因过量表达后能提高转基因植物对冻害、冷害和干旱等多种逆境的抗性。本项目还揭示了MfMIPS1、MfGolS1、MfSAMS1、MfTIL、MfERF和MfcpCOR14等基因提高抗逆性的机制。例如，提出了低温诱导MfSAMS1表达，促进多胺合成，诱导多胺氧化酶基因表达，进一步氧化多胺产生H2O2，诱导包括抗氧化酶基因等基因的表达，从而提高抗寒性的机制；发现了一个新的未知功能蛋白MfcpCOR14，通过激活GAPDH，提高植物的光合速率，促进植物生长，提高抗寒性。