光合相关基因CP12的表达及调控与柱花草抗寒性的关系

柱花草是热带亚热带地区重要的优质豆科牧草，冷害是限制柱花草生长与生产的主要环境因子，研究柱花草抗寒分子机理有重要科学意义和潜在应用价值。然而，除本实验室外，未见有关柱花草抗寒性的研究报道。在已研究柱花草抗寒突变体"7－1"的抗冷机理、发现光合相关基因与抗寒性关系密切基础上，本项目拟克隆光合相关基因CP12的cDNA全长，研究超量表达CP12的转基因植物（35S∶CP12）抗寒性及光合特性，分析低温诱导CP12基因表达的动态变化，比较柱花草抗寒突变体与其亲本间的差异，证明CP12基因表达在柱花草抗寒性中起重要作用。进一步克隆CP12基因启动子，以转基因植物（CP12∶GUS）验证启动子活性，比较分析抗寒突变体与其亲本启动子序列及调控元件的差异，揭示柱花草CP12基因表达受低温诱导、抗寒突变体比其亲本的CP12基因响应低温更迅速、上调幅度更大的原因。研究结果可为揭示柱花草抗寒分子机制奠定基础。

本项目在比较柱花草耐寒突变体及其亲本CIAT184（184）抗冷性差异基础上，测定了低温过程中两类材料间抗氧化系统和各个光合参数的动态变化，结果表明突变体具有较高的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量，因而能更好地保护光合系统免受低温伤害，是其提高抗寒性的生理机制。进一步采用抑制性消减杂交方法，比较、筛选出突变体7-1和184响应低温的差异表达基因，并采用定量RT-PCR对部分差异基因进行了验证，结果表明CP12基因的表达在两个材料间差异明显。采用Tail-PCR从7-1和184基因组DNA克隆了CP12启动子，结果表明，7-1启动子序列与184的序列存在差异，这种差异导致7-1的启动子区域增加了几个响应低温的元件，使得低温下CP12基因在7-1的表达量高于184。从7-1和184分别克隆了CP12基因的cDNA全长和DNA序列，序列分析表明，两个材料间CP12的ORF区仅有1个核苷酸的差异，其编码的蛋白序列存在1个氨基酸的差异。构建了CP12基因的超量表达载体和反义表达载体，获得了表达正义和反义CP12的转基因柱花草和烟草。转基因植物的分子检测表明，过量表达植株具有更高的CP12转录本，而反义植株中CP12的转录本低于野生型植株。检测了转基因植物的抗冷性，结果表明，过量表达CP12的转基因柱花草和烟草的抗冷性高于野生型，而反义植株的抗冷性降低。此外，我们还发现过量表达植株比野生型高大，生物量提高，而反义植株矮小，生物量降低。进一步分析了转基因植物及其野生型光合碳代谢关键酶的活性及还原当量（NADPH/NADP），揭示了CP12调控抗冷性与生长的机制。本项目研究已在SCI刊物（Agron J，农学二区）和国内核心学报各发表1篇论文，拟向IF5以上刊物投稿论文1篇。