Grina调控斑马鱼耐寒能力的分子机理研究

Temperature is a critical environmental factor that controls life activities of fish. Many cultured and economically important fish are sensitive to low temperature and low temperature in excess of their tolerance can reduce growth and immunity, leading to cell apoptosis and individual death. However, molecular mechanisms underlying cellular apoptosis and individual death at low temperature remain largely unknown. Zebrafish contains two homologous genes grinaa and grinab. We have obtained zebrafish homozygous grinaa-mutants. A large amount of apoptotic cells appeared in developing grinaa-mutant embryos exposed to low temperature and the ability of juvenile resistant to low temperature decreased significantly. Based on our previous findings, the project intends to carry out key researches as follows: 1) molecular mechanisms underlying cell apoptosis and individual death of grinaa mutants occurred under the condition of low temperature; 2) development of grinab mutants and dissection of functional differences of Grinaa and Grinab in the regulation of zebrafish cold acclimation; 3) identification of proteins interacting with zebrafish Grinaa/Grinab; 4) molecular mechanisms of IP3R interaction with Grinaa/Grinab; 5) mechanisms of transcriptional regulation of grinaa/grinab genes. The approval and implementation of this project will reveal molecular mechanisms of Grina functions in the regulation of zebrafish cold resistance and provide a theoretical basis for the breeding of cold-resistant cultured fish species.

温度是控制鱼类生命活动的关键环境因子。许多养殖经济鱼类不耐低温，超出耐受范围的低温可降低其生长率和免疫力，导致细胞凋亡和个体死亡。然而，低温诱导鱼类细胞凋亡和个体死亡的分子机制尚不清楚。斑马鱼具有grinaa和grinab两个同源基因，我们已获得grinaa纯合突变体，低温暴露时其胚胎细胞大量凋亡，幼鱼的耐低温能力显著降低。在此基础上，本项目拟重点开展如下研究：1）低温条件下grinaa突变体发生细胞凋亡和个体死亡的分子机制；2）研制grinab突变体，比较Grinaa和Grinab在斑马鱼低温适应形成中的功能差异；3）鉴定与斑马鱼Grinaa/Grinab相互作用的蛋白；4）Grinaa/Grinab与IP3R相互作用的分子机制；5）grinaa/grinab基因的转录调控机制。本项目的获准与实施，将揭示Grina调控斑马鱼耐寒能力形成的分子机理，为鱼类耐寒育种提供理论依据。

温度是一个关键的环境因子，可影响鱼类几乎所有的生理生化过程，进而影响鱼类的一切生命活动。鱼类的正常生长繁殖要求在特定的环境温度范围内进行，环境温度超出鱼类可耐受的温度范围，就会对鱼体造成损伤，甚至导致鱼体死亡。因此，对生活在多变水体环境的变温鱼类来说，其生长和繁育要求其具有快速应对外界环境温度变化的能力；然而，我们目前并不清楚鱼类对外界低温环境产生应答的生理生化和分子机制。.Grina属于BI-1家族的一个膜蛋白，可与内质网上的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3Rs)结合调节内质网钙稳态，参与调节细胞内质网应激等各种凋亡反应，抑制细胞凋亡。在本研究中，我们通过已获得的grinaa纯合突变体，主要开展的研究内容有：1）低温条件下grinaa突变体发生细胞凋亡和个体死亡的分子机制；2）斑马鱼Grina(包括Grinaa和Grinab)与其他物种同源蛋白质序列对比；3）鉴定了与斑马鱼Grinaa相互作用的蛋白；4）Grinaa与IP3R相互作用的分子机制；5）grinaa基因的转录调控机制。通过以上研究工作揭示了Grina调控斑马鱼耐寒能力形成的分子机理。.本研究发现，在16°C低温处理条件下，grinaa纯合突变体与野生型胚胎相比具有较高的死亡率，更多的细胞凋亡，且对内质网应激更加敏感。使用胞质钙离子螯合剂BAPTA-AM或者内质网IP3R钙离子通道抑制剂2-APB处理斑马鱼胚胎，均能减轻低温诱导的细胞凋亡，说明内质网释放的钙离子在低温诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。本研究还发现，低温诱导的细胞凋亡与胞内钙紊乱、线粒体膜电位降低、细胞色素C释放以及caspase-9和caspase-3激酶活化等密切相关。此外，低温诱导的内质网应激反应与低温抑制Ca2+-ATP酶(SERCA)活性有关。这些结果表明，斑马鱼胚胎细胞内存在一个对低温信号敏感并经内质网应激传递的细胞凋亡信号通路，Grinaa通过降低内质网应激反应来抑制低温诱导的斑马鱼胚胎细胞凋亡。.总之，本研究发现低温通过诱导斑马鱼胚胎细胞发生内质网应激反应，激活线粒体介导的细胞凋亡信号通路，最终导致胚胎细胞的凋亡。这一研究有望为斑马鱼耐寒研究和经济鱼类耐寒品系的培育找到突破的方向。