几丁质合酶基因调控玉米大斑病菌细胞壁发育及侵染的分子机制

In our previous study, we found that StSte12, a key transcription factor, downstream Fus3/Kss1 MAPK cascade pathway, was involved in regulating appressorium development and infection process in Setosphaeria turcica. The transcription factor could directly bind in the special site of promoter region in chitin synthase gene StCHS5 and control its expression. Moreover, our results showed that StSte12 probably combined with the other chitin synthase genes, StCHS3 and StCHS7, and regulate their expression. In this project, we will confirm the interaction between StSte12 and StCHS3; StSte12 and StCHS7 in virtue of chromatin immunoprecipitation (ChIP), yeast single hybridization (Y1H) and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Target gene mutagenesis (TGM) will be conducted using CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) /Cas9 gene edting technology to create gene knockout mutants.The functions of StCHS3, StCHS5 and StCHS7 will be illuminated by comparing their differences between the wild-type strain and gene knockout mutants in cell wall development, appressorium development, infection process and so on. In summary, the project will clarify the molecular mechanism that StSte12 regulates cell wall development and pathogenicity by directly combining with some chitin synthase genes. The research results will not only illuminate the molecular mechanism of Fus3/Kss1 MAPK cascade pathway in regulating cell wall development and pathogenicity, but also lay the foundation for developing new fungicides in the future.

本课题组前期研究发现，玉米大斑病菌 Fus3/Kss1 MAPK 级联途径下游的核心转录因子StSte12调控病菌附着胞发育及侵染过程，它直接结合于StCHS5的启动子区域调控其表达；此外，几丁质合酶基因StCHS3、StCHS7也可能受StSte12所调控。本研究拟通过染色质免疫共沉淀、酵母单杂交、凝胶阻滞等技术验证StSte12与几丁质合酶基因StCHS3、StCHS7的直接作用关系；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制几丁质合酶基因敲除突变体，比较突变体与野生型菌株在细胞壁和附着胞发育以及侵染过程中的差异，明确靶基因的功能，阐明StSte12通过直接作用于几丁质酶基因来调控病菌细胞壁发育及侵染的分子机制。该研究不仅将深入诠释植物病原真菌Fus3/Kss1 MAPK 级联途径调控病菌细胞壁发育及致病性的分子机制，也可为研制新型杀真菌制剂奠定基础。

本项目依照计划书要求，针对转录因子StSte12对几丁质合酶基因的调控作用以及受其调控几丁质合酶基因的功能进行了系统的研究，旨在阐明StSte12通过直接作用于几丁质酶基因来调控病菌细胞壁发育及侵染的分子机制。同时也与病菌侵染致病密切相关的重要几丁质合酶基因的功能进行了研究。主要结果为：①通过全基因组分析发现玉米大斑病菌中包含8个几丁质合酶基因，可分为7类，3个亚家族；表达谱分析发现StCHS2、StCHS5、StCHS6、StCHS7等基因与病菌的侵染致病密切相关。②基于StSTE12突变体，利用RNA-Seq、Real-time PCR等技术明确了转录因子StSte12对几丁质合酶基因StCHS3、 StCHS5、StCHS7具有调控作用；接着利用染色体免疫共沉淀结合PCR技术进一步确定了StSte12对StCHS5的直接调控作用。③克隆了StCHS5基因，全长为5780 bp，cDNA序列为5301 bp，其蛋白质产物包含肌动蛋白结构域、细胞色素b5结构域和几丁质合成酶催化结构域II。进一步通过创制该敲除和过表达突变体分析了该基因的功能，发现StCHS5参与了玉米大斑病菌的生长发育过程，对病菌的生长速率、菌落颜色、分生孢子产量和黑色素含量均有影响；参与了病菌细胞壁的形态建成，对细胞壁干扰物质的敏感性、几丁质含量及分布、细胞壁超微结构等均有影响；参与大斑病菌的附着胞发育及侵染过程，但对病菌的致病毒素的毒力没有影响，敲除突变体不能形成正常的附着胞和侵入钉结构，不能穿透玻璃纸，不能侵染健康的玉米叶片，但能够侵入并定殖在刺伤的寄主中。④克隆了StCHS6基因，全长为3584 bp，cDNA序列为2703 bp，其蛋白质产物包含典型的几丁质合酶催化结构域I和多个跨膜结构域。进一步通过创制该敲除突变体分析了该基因的功能，发现StCHS6参与了玉米大斑病菌的生长发育过程，对病菌的生长速率、菌落形态和分生孢子产量均有影响；参与了病菌细胞壁的形态建成，对细胞壁干扰物质的敏感性、几丁质含量及分布等均有影响；参与病菌侵染致病过程，敲除突变体附着胞发育延迟、透玻璃纸膜的能力减弱、对健康玉米和刺伤叶玉米叶片的致病力均降低。