伊蚊酚氧化酶生化特性以及对单酚化合物识别机制的研究

The mosquito is an ectoparasite and transmits many diseases. Mosquitoes are diptera insects. Insect phenoloxidase catalyzes the formation of melanin，is involved in cuticle and eggshell formation, wound healing and encases and kills invading pathogens. Insect phenoloxidases are usually first expressed as prophenoloxidases (PPOs), which are activated by processes such as proteolysis. Mosquitoes contain an especially large number of PPOs as compared with other insects. However, the specific biochemical functions of the mosquito PPOs are not clear. This project will use advanced methods in molecular biology, enzymology, computational biology, and protein crystallography to characterize phenoloxidases from the mosquito Aedes aegypti, analyze the substrate binding sites and finally find key amino acid residues of Aedes phenoloxidases for determining monophenolic compounds specificity. The results obtained in this project will provide useful references for insect PPOs classification, PPO coding genes annotation and naming. It will also contribute to the PPO inhibitor design for possible mosquitocide discovery.

蚊虫是重要的外寄生虫，又是第一大疫病传播生物媒介。分类学上，蚊属于双翅目昆虫。昆虫的酚氧化酶可以催化黑色素的合成，参与表皮与卵壳的形成、创口愈合和包裹的形成， 以及通过氧化产生的活泼自由基杀死入侵的病原体。所以研究蚊的酚氧化酶有助于理解蚊的传播病原的机制和防御机制。昆虫体内的酚氧化酶通常先以酚氧化酶酶原（Prophenoloxidase，PPO）的形式存在，然后通过蛋白酶水解等过程激活。相比较于其他昆虫，蚊子体内有更多的PPO基因，但是这些PPO的具体生化功能尚不清楚。本项目将利用分子生物学、酶学、计算生物学、晶体学等研究手段，通过测定伊蚊不同酚氧化酶的生化特性，并分析比较其结构特征， 最终找到伊蚊酚氧化酶识别单酚化合物的关键氨基酸残基。本项目的研究结果可望对昆虫PPO的分类和命名或注解提供试验依据，并有助于PPO抑制剂的设计。

蚊虫是重要的疾病传播生物媒介，严重危害公共卫生安全。黑化反应是昆虫的先天免疫反应，酚氧化酶是反应中重要的限速酶。昆虫的酚氧化酶参与表皮与卵壳的形成、创口愈合和包裹的形成，以及通过氧化产生的活泼自由基杀死入侵的病原体。因此研究蚊虫的酚氧化酶有助于理解蚊虫的免疫防御机制。酚氧化酶通常以酶原（Prophenoloxidase，PPO）的形式存在于昆虫体内，通过丝氨酸蛋白酶的级联调控来激活，变成有活性可发挥功能的酶。相较于其他昆虫，蚊虫体内有更多的PPO基因，但它们的具体生化功能尚不明确。本项目通过生物信息学分析将14个酚氧化酶分为两类，一类以PPO10为代表，既可以羟基化单酚化合物，也可以氧化双酚化合物，另一类以PPO6为代表，仅仅可以氧化双酚化合物。对蛋白进行同源建模与底物对接及序列比对，预测了PPO6中F215、E216和PPO10中G217、D218可能是影响酶活性的关键活性位点，而PPO10活性位点周围一段多肽G215DGPDSSVVR223可能是识别单双酚化合物的关键。利用氨基酸点突变方法将PPO6蛋白氨基酸序列第215位点上的苯丙氨酸F突变为谷氨酸G，PPO6活性位点周围关键多肽F215EASNRAIVD224突变为PPO10的多肽G215DGPDSSVVR223（PPO6 cm），验证了 G215DGPDSVVR223是识别单双酚化合物的关键氨基酸残基片段。同时利用晶体学方法，本项目解析了PPO6 cm的晶体结构，并通过与酪氨酸底物的对接进一步证明了G215DGPDSVVR223为关键氨基酸残基片段，同时晶体结构的解析也为理解PPO催化机制提供了基础。