伊蚊柔性表皮合成关键酶---3，4-二羟基苯乙醛合成酶的生化特性测定、结构解析和酶促反应机制分析

Mosquitoes are responsible for transmitting many devastating zoonoses, some of which, such as Dengue fever, result in significant morbidity and mortality throughout the world. Mosquito control has been proved to be an effective approach to prevent mosquito-borne diseases. However, because mosquitoes have developed severe resistance to most pesticides, the development of new mosquitocides is urgently needed. Cuticle is the most important structure that protects mosquitoes and other insect species from adverse environmental conditions; consequently, this structure has been a primary target for insect pest control. Formation of protective, highly flexible cuticle is particularly crucial in female mosquitoes because their abdomen must accommodate a bloodmeal that can be equivalent to their own body weight. Our recent data revealed that Aedes aegypti mosquitoes contain two novel enzymes that are involved in flexible cuticle formation by producing 3,4-dihydroxyphenylacetalde (DOPAL), which is highly reactive and directly participates in cuticle protein crosslinking. The objective of our research proposal is to obtain (1) the biochemicl and structural characteristics of DOPAL synthase and (2) determine the critical residues for ligand binding of the enzyme. This information will be used in structure-based drug design to validate the enzyme as a target for mosquitocide development.

蚊虫不仅是一种外寄生虫、动物养殖场的"三害"之一，而且还可传播许多重要的人兽共患病，如疟疾、登革热、乙型脑炎、丝虫病等。蚊虫的控制是防制蚊媒病的最有效方法。然而，由于普遍存在的抗药性问题，迫切需要发展新型杀蚊剂。表皮是蚊子和其它昆虫抵御不良环境的重要结构；因此，蚊虫参与表皮合成的酶已成为杀虫剂研发的重要靶标。我们首次鉴定了埃及伊蚊的3，4-二羟基苯乙醛（DOPAL）合成酶， 它可通过催化生成DOPAL直接参与蛋白的交联以合成蚊虫的柔性表皮。我们认为通过抑制酶的活性而阻断蚊虫柔性表皮的合成可能会起到控制蚊虫的作用。本项目拟通过分子生物学、结构生物学及酶学的手段，（1）研究DOPAL 合成酶的生化特性、解析它的立体结构； (2) 确定酶与底物/抑制剂结合的关键残基、并分析酶促反应机制。此项目获得的信息将可用于基于结构的酶抑制剂设计，为今后杀蚊剂研究的药物靶标的确认打下基础。

蚊虫不仅是一种外寄生虫，动物养殖场的三害之一，而且还可以传播许多疾病，例如疟疾，登革热，乙型脑炎，丝虫病等。蚊虫控制是防制蚊媒病的最有效的方法。然而由于普遍存在的抗药性，迫切需要发展新型杀虫剂。表皮是蚊虫抵御不良环境的重要结构，因此参与蚊虫表皮合成的酶已成为杀虫剂研发的重要靶标。我们首次鉴定了3，4-二羟基苯乙醛(DOPAL)合成酶，它可以通过催化生成DOPAL直接参与蛋白的交联以合成蚊虫的柔性表皮。本项目通过分子生物学、结构生物学、计算生物学及酶学手段研究了DOPAL合成酶的生化特性，解析了它的晶体结构，确定了酶与底物／抑制剂结合和催化脱氨基反应的关键残基。本研究项目证明了DOPAL合成酶的辅酶是磷酸吡多醛。随后检测了埃及伊蚊DOPAL合成酶，果蝇DOPAL合成酶和DDC在酶促反应最佳条件下的酶动力学参数。对果蝇DOPAL合成酶进行同源建模，并与DDC的晶体结构比较，表明它们在结构上具有高度相似性。通过点突变分析说明Asn192是DOPAL合成酶的关键催化残基。对果蝇DOPAL合成酶的晶体结构解析显示磷酸吡多醛通过与活性中心的Lys残基以共价连接形成复合物。根据果蝇DOPAL合成酶的晶体结构，构建了埃及伊蚊DOPAL合成酶的结构模型。这一模型可用于蚊虫DOPAL合成酶抑制剂的设计，为今后研究新型杀蚊药打下基础。